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绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异
性鉴定
董彬;胡贺贺;王晶;孟德梅;樊振川
【摘要】绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧
光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使
之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全
序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和pGEX-
2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后
进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为
2.6×104和5.2×104的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-
GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕
32,000.抗血清依次经ProteinA亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印
迹实验(Westernblot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地
识别在莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达
的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.%GFPisoneofthemost
popularfluorescentproteinsusedtodetectandquantifytargetedproteins
inlivingorgan-isms.Todevelopahighsensitiveantibodyforitsdetection
orsignalcaptureindifferentkindoforganisms,6×His-taggedandGST-
taggedprokaryoticexpressionplasmids,pET28A-gfpandpGEX-2T-
gfp,wereconstructed,byinsertinggfpintothepGEX-2TandpET28Avectors
respectivelyandthenweretransformedintoEscherichiacoliBL21(DE3)for
proteinexpres-sion.12%SDSanalysisresultsshowedthatthe
molecularweightsofthefusionprotein6×His-GFPandGST-GFPwere
2.6×104and5.2×104,respectively.The6×His-GFPfusionproteinwas
purifiedbyaffinityadsorptionpurificationtoimmunizeNewZealandwhite
rabbits.The5thimmuneserumwascollectedandtheantibodytiterwas
determinedtobe1﹕32,000byELISA.Theantiserumwaspurifiedby
ProteinAaffinityadsorptionpurificationandimmobilizedGST-GFPpuri-
fication,andthespecificityofpolyclonalantibodieswasevaluatedby
Westernblotinthreekindoforganismsincludingchlamydomonas,HEK293
cellsandbacteria.Resultsshowthatthepolyclonalantibodypreparedcan
specificallyandpre-ciselybindGFPinallkindoforganisms,whichcanbe
usedformoreGFPandGFPrelatedresearch.
【期刊名称】《天津科技大学学报》
【年(卷),期】20
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