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葡萄糖氧化酶耐热性测定水浴法

1范围

本文件规定了以水浴法测定葡萄糖氧化酶的耐热性，适用于测定酶蛋白的耐热性。本文件适用于耐热型葡萄糖氧化酶产品，适用于固态及液态产品。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1葡萄糖氧化酶活性单位Glucoseoxidaseactivityunit

在温度37℃,pH6.0的条件下，1min催化β-D-葡萄糖氧化产生出1μmoL过氧化氢所需的酶量，即为1个酶活力单位，以U表示。

3.2

酶活性存留率enzymeactivityretentionrate

未经热处理酶活性为初始酶活性，经高温处理后为处理后酶活性，处理后酶活性与初始酶活性的比值为酶活性存留率。

4原理

将葡萄糖氧化酶试样稀释至一定浓度，通过试管在恒温水浴锅中高温处理，检测试样在高温条件下的酶活性变化，测定葡萄糖氧化酶的耐温酶活性存留率。

5试剂或材料

除非另有说明，仅使用分析纯试剂。

5.1水：GB/T6682，三级。

5.20.1mol/L磷酸二氢钠溶液：称取15.605gNaH2PO4·2H2O，加水溶解并定容至1L。

5.30.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取35.82gNa2HPO4·12H2O，加水溶解并定容至1L。

5.40.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取0.1mol/L磷酸二氢钠溶液877mL，0.1mol/L磷酸氢二钠溶液123mL混和成磷酸盐缓冲液，再用0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液或0.1mol/L的磷酸二氢钠溶液调节pH至6.0。

6仪器设备

6.1分析天平：精度0.0001g。

6.2pH计：精确至0.01。

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6.3恒温振荡器：精确至±1.0℃。

6.4恒温水浴锅：精确至±0.1℃,带循环水泵。

6.5秒表：每小时误差不超过5s。

6.6离心机：转速4000r/min以上。

7试验步骤

7.1样品制备

7.1.1固态样品

平行做2份试验。称取0.2~1g试样，精确至0.0001g，置于锥形瓶中，加入100mL磷酸盐缓冲液（5.4），置于25℃恒温振荡器中提取30min，室温静止10min，离心或过滤，取上清液或滤液，使用磷酸盐缓冲液（5.4）进行稀释，将葡萄糖氧化酶活性控制为2~20U/mL，作为待处理酶稀释液。

7.1.2液态样品

平行做2份试验。移取0.2~1mL试样，使用磷酸盐缓冲液（5.4）进行稀释，将葡萄糖氧化酶活性控制为2~20U/mL，作为待处理酶稀释液。

7.2初始酶活性的检测

参考附录A，检测以上待处理酶稀释液的初始酶活，记为U。

7.3水浴法处理

取5mL待处理酶稀释液于10mL带盖玻璃试管(φ15×100mm，保持试管一致性）中，置于（75℃、80℃、85℃、90℃)水浴锅（水浴锅开孔位φ60mm，水浴锅水位加至边沿下2cm处）中，精确计时5min，立即取出放入冰水浴中，冷却至室温。

参考附录A，检测热处理后酶活性，记为U1。

8试验数据处理

8.1结果计算

酶活性存留率按式（1）计算：

K=×100%………………(1)

式中：

K—酶活性存留率，%；

U—初始酶活性；

U1—高温处理后酶活性。

8.2结果表示

平行试样的测定结果用算术平均值表示，计算结果小数点后保留两位有效数字。

9精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。

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附录A

（资料性）

葡萄糖氧化酶活性测定方法

A.1原理

在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和棕色的氧化型邻联茴香胺，棕色的氧化型邻联茴香胺与硫酸溶液反应变为粉红色，可于波长540nm处比色测定。

A.2试剂和材料

除非另有说明，仅使用分析纯试剂。

A.2.1水：GB/T6682，三级。

A.2.20.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）

甲液0.1mol/LNaH2PO4·2H2O：称取15.605gNaH2PO4·2H2O，加水溶解并定容至1L。乙液0.1mol/LNa2HPO4·12H2O：称取35.82gNa2HP