真核基因表达系统.ppt

3、受体细胞1）sf（秋粘虫）细胞2）Bm（家蚕）细胞3）昆虫幼虫二、受体细胞第96页,共97页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第97页,共97页，星期六，2024年，5月2）增强子许多来源于病毒的增强子在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力SV40enhancerRSVenhancerCMVenhancerLTRenhancer第64页,共97页，星期六，2024年，5月3）筛选标记胸苷激酶(tk)基因

Thymidinekinasegene二氢叶酸还原酶(dhfr)基因Dihydrofolatereductase,dhfr新霉素抗性基因neomycinresistancegene第65页,共97页，星期六，2024年，5月胸苷激酶(tk)基因tk+细胞中：胸苷(T)→胸苷一磷酸二氢叶酸二氢叶酸还原酶四氢叶酸dCTPdATPdTTP氨基喋呤(Aminopterin)tk阻断补加次黄嘌呤（Hypoxanthine）死亡存活DihydrofolateThymidine（1）（2）（3）HAT第66页,共97页，星期六，2024年，5月二氢叶酸还原酶基因筛选法原理携带外源基因的载体连接有dhfr基因，可以表达二氢叶酸还原酶以dhfr-细胞为受体:CHO细胞dhfr-细胞无法在普通培养基中存活，而转化入dhfr基因后可以存活，并表达外源基因。若在培养基内加入甲氨蝶呤，进行加压筛选，可以提高外源基因表达量第67页,共97页，星期六，2024年，5月新霉素的类似物G418对原核、真核均有毒neo编码的酶可使G418灭活此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便新霉素抗性基因(neo)第68页,共97页，星期六，2024年，5月4）转录终止信号和多聚腺苷酸信号使转录后的mRNA能有效进行切割和多聚腺苷酸化第69页,共97页，星期六，2024年，5月多聚腺苷酸信号第70页,共97页，星期六，2024年，5月5）复制元件：使载体在受体细胞中复制，提高外源基因的表达水平6）原核细胞的部分序列在原核细胞复制的复制起始为点（ori)在原核细胞复制筛选的抗生素抗性基因（AMPr）第71页,共97页，星期六，2024年，5月复制元件复制元件第72页,共97页，星期六，2024年，5月

1）非病毒性载体2）病毒性载体：腺病毒，慢病毒等2、载体的类型第73页,共97页，星期六，2024年，5月1）非病毒型(复制子型,质粒型）由真核复制信号、启动子,转录单位及质粒片段组成,不需要包装细胞。如：pSV系列、pCDNA3等(二）载体的类型第74页,共97页，星期六，2024年，5月第75页,共97页，星期六，2024年，5月2）病毒型载体外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重组DNA随病毒颗粒而复制(多需辅助病毒或包装细胞的存在)。如：逆转录病毒载体、腺病毒载体等第76页,共97页，星期六，2024年，5月病毒型载体的类型整合型整合入宿主染色体，随染色体复制而复制可持续表达外援基因安全性低：插入诱变SV40载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体游离型不整合生物安全性高瞬时表达腺病毒载体、痘苗病毒载体第77页,共97页，星期六，2024年，5月1、CHO细胞（中国仓鼠卵巢癌细胞）----------可大规模培养2、COS细胞（猴肾细胞系）：可合成SV40复制的大T抗原，可使每个细胞中的SV40载体拷贝数多达10万个，适合于大量表达SV40载体上的基因3、其他动物的细胞：如Hela细胞（人宫颈癌细胞）、HEK293细胞二）受体细胞------哺乳动物细胞第78页,共97页，星期六，2024年，5月三）基因转移技术转化：将质粒或以质粒为载体构建的重组DNA导入细胞的方法。1.磷酸钙共沉淀法2.DEAE-Dextran3.脂质体转染法：4.电穿孔法5.显微注射法6.受体介导的基因转移方法转染：将病毒或以病毒为载体构建的重组DNA导入细胞的方法第79页,共97页，星期六，2024年，5月脂质体