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基因突变分析技术研究进展

摘要：基因突变(genemutation)或点突变(pointmutation)是组成遗传物质的

DNA分子中碱基的变化，这种变化是无法用显微镜直接观察，但能在基因水平上

检测的或通过遗传学实验来证明的、能遗传的改变。基因突变可发生在个体发育

的任何时期，发生在体细胞时，可引起生物体的异常或得肿瘤；发生在生殖细胞

时，引起遗传病。基因突变分析是确定某一未知基因与某遗传病之间关系的关键

步骤,也是临床上对病人进行基因诊断的重要手段,本文对多种基因突变分析

技术进行了分类综述,并对毛细管电泳在基因突变检测中的应用进行了详细介

绍。

关键词：基因突变；分析技术；应用

据估算人类基因组中约包括5～10万个基因,它们分布在24个不同染色体和

线粒体上,到1998年1月为止,已克隆的人类功能基因达到5052个,但确定与某一

特定遗传病相关的基因只有821个,目前已被认定的孟德尔遗传病1402种,这些病

都至少与一个或几个基因的突变相关。研究人类的全部基因,特别是与疾病相关

的基因的结构、功能以及各种基因突变与疾病的关系,是人类认识遗传病的发病

机理,并最终达到对遗传病进行基因诊断和基因治疗的重要环节。

从20世纪80年代开始,一系列寻找新基因的方法得以应用,但要确定哪一个

基因是该病的致病基因,还需在相应的病人中进行突变检测。在过去的十几年中,

虽然已有多种突变分析的技术得到发展,但总的来说,寻找一种快速、高效而又经

济的方法仍然是很多科研工作者的研究目标。本文对突变分析的种种方法进行了

分类综述。

突变分析技术按其研究对象主要分为两大类,即:①对未知突变进行分析,即

确定某一未知基因与某遗传病的关系；②对已知突变进行分析,即在临床上对致

病基因已克隆的遗传病进行基因诊断。在实际应用中许多检测未知突变的方法也

可用来对已知突变进行检测。

1对未知突变进行分析的方法

1.1化学切割错配(chemicalcleavageofmismatch,CCM)

化学切割错配是在Maxam-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测

技术,在DNA∶DNA或DNA∶RNA异源杂合双链核酸分子中，错配的C能被羟

(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,错配的T能被四氧化锇(Osmium

tetroxide)所切割,切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变【1】。只

要操作得当,不会发生非特异性切割,如果对正义链和反义链都进行分析,可使

检出率达100%；使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出

十个细胞中的一个突变细胞。该方法的最大优点是能对长至2kb的片段进行分析,

并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。

1.2单链构象多态性(Single-StrandConformationalPolymorphism,SSCP)

该方法的原理是【2】:单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构

依赖于其碱基组成,即使是一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构并引起在

非变性电泳条件不同的电泳迁移率。由于SSCP法简单快速，因而被广泛应用于未

知基因的突变分析和临床检测。该方法最主要的问题是不能检测到所有的突变,

由各实验室报导的突变检出率从99%到35%不等。由于随DNA片段大小的增加,迁

移率的改变明显减小,故而该方法只适合用来检测150～200bp的DNA片段。一般来

说对小于200bp的片段其检出率可达90%,而对大至400bp的片段,其检出率可能只

有70%～80%。同时该方法要求多次摸索条件,如电泳温度,胶中甘油浓度以及胶联

度等均可影响检测的灵敏度。至于突变类型,除G到T的置换外,似乎对其检测的灵

敏度并无大的影响,此外,该方法不能确定突变的精确位置。尽管如此,由于SSCP

的使用简单便利,科研工作者在应用中对其进行了不断地改进,这些改进包括:优

化电泳条件,多重PCR的使用,对较大片段的PCR产物先进行酶切消化再跑电泳,毛

细管电泳取代普通胶电泳以及自动测序仪的使用等。尽管这些改进增加了该方法

的复杂度和花费,但却使SSCP的检出率大大提高,接近于100%。此外，使用RNA

分子来做SSCP会提高其灵敏度,尤其是对大于200pb的片段。

1.3RNA酶A切割(RnaseAcleavage)

在一定条件下,异源双链核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中的错配碱基可