H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法.docxVIP

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H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法

1范围

本文件规定了H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR的检测方法。

本文件适用于快速检测咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、组织样品等临床样品中H7N9亚型禽流感病毒。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T18088出入境动物检疫采样

GB/T18936高致病性禽流感诊断技术

GB19442高致病性禽流感防治技术规范

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语与缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct值Cyclethreshold，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数

DEPCdiethylprocarbonate，焦碳酸二乙酯

PBSphosphatebuffersaline，磷酸盐缓冲液

FAM6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素

RT-PCRreversetranscriptionPolymeraseChainReaction,反转录聚合酶链式反应

4原理

采用TaqMan方法，选择H7N9毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H7N9检测的靶序列。采用DNAMAN软件对Genebank公布的所有序列进行Blast比较后，分别在各自的高度保守序列内进行引物和探针的设计。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3’端标记BHQ荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，根据荧光信号的强弱来进行结果判定。

5仪器与试剂

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5.1仪器与材

料

实时荧光PCR仪；高速冷冻离心机（最高离心力达15000g以上）；生物安全柜；混匀器；冰箱（2℃~8℃,-20℃,-80℃);微量可调移液器（10μL,100μL,1000μL）；微量带滤芯吸嘴（10μL,100μL,1000μL）；灭菌研钵；离心管；PCR光学反应管。

5.2试剂

5.2.1试剂级别

除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的一级水，所用化学试剂均为分析纯。

5.2.2引物与探针

H7N9禽流感H7和N9的引物及探针（附录B）。采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100μmol/L储存液，置-20℃或更低温度冻存。使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。

5.2.3一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

5.2.4阳性对照为灭活疫苗，-20℃保存备用。阴性对照样品为SPF动物的拭子样本或组织悬液，空白对照样品为试剂盒本身试剂不加模板。

5.2.5其他试剂

DEPC水(按照附录A制备，推荐使用商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水)；三氯甲烷；异丙醇；无水乙醇；70％乙醇（用新开启的灭菌双蒸水配制，-20℃预冷）；0.01mol/LPBS（pH7.2，

配制方法见附录A）。

6生物安全要求

样品采集、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应参照GB19489的规定进行。

7样品采集和前处理

7.1样品采集

7.1.1一般要求

样品的采集、保存及运输应符合GB/T18088、GB/T18936和GB19442的相关要求。

7.1.2禽的相关病毒样品采集

将两个灭菌的棉拭子于PBS溶液中浸湿，取一个棉拭子先插入活禽喉头口及上腭裂来回刮3～5次并慢慢旋转2～3次，取咽喉分泌液；再将另一个棉拭子插入该禽的泄殖腔内1.5cm～2cm轻轻擦拭3~5次并旋转2～3次；将咽喉拭子和泄殖腔棉拭子一起放入盛有1mL灭菌的0.01moL/LpH7.2PBS(内含青霉素2000IU/mL，链霉素2mg/mL)中，加盖、编号，为一个活禽样。小珍禽采咽喉/泄殖腔拭子容易造成伤害