《microRNA定量检测》课件.pptVIP

**************什么是microRNA生物小分子microRNA是长度只有18-25个核苷酸的非编码小分子RNA,是生物体内重要的调控分子。基因表达调控microRNA通过与靶基因mRNA的特异性结合,抑制或促进基因表达,发挥重要的生物学功能。多种生理病理过程microRNA广泛参与细胞发育、分化、增殖、凋亡等过程,其异常表达与多种疾病发生相关。microRNA的结构特点microRNA是一类长度约21-25个核苷酸的非编码小分子RNA。它们具有独特的单链环状二级结构,采用发卡发夹式折叠,精确切割而成。这种特殊结构使得microRNA能够与靶基因的mRNA结合,调控基因表达。microRNA通常由一个前体RNA经过Dicer酶的切割而成熟。成熟后的microRNA就可以与Argonaute蛋白结合,进入RNA诱导的沉默复合体(RISC)参与转录后基因沉默。microRNA的生物学功能基因表达调控microRNA能够通过与目标mRNA结合而抑制蛋白质翻译或诱导mRNA降解,从而精细调控基因表达。细胞发育调控microRNA在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用,参与调控细胞命运的决定。免疫应答调控microRNA能够调节免疫细胞的分化和功能,在免疫反应的启动、维持和终止中起关键作用。代谢过程调控microRNA可以调节葡萄糖代谢、脂肪代谢等多种代谢通路,维持机体代谢稳态。microRNA在疾病中的应用肿瘤诊断microRNA可检测多种肿瘤,如肺癌、乳腺癌等。具有高灵敏度和特异性,结合传统检查方法可提高肿瘤早期诊断率。心血管疾病诊断一些特异性microRNA可作为心梗、心衰等心血管疾病的生物标志物,帮助早期诊断和病情监测。神经系统疾病诊断微小RNA参与神经系统的发育和功能调控,其异常表达与帕金森、阿尔茨海默等神经系统疾病的发生有关。microRNA检测方法概述1芯片检测高通量快速检测多个microRNA表达2Northernblot定性分析检测成熟microRNA3RT-qPCR灵敏度高，定量分析小RNA表达microRNA检测技术主要包括芯片检测、Northernblot和RT-qPCR三种方法。芯片检测可以快速高通量地检测多个microRNA的表达情况。Northernblot用于定性分析成熟microRNA分子。RT-qPCR则具有灵敏度高、可定量分析小RNA表达水平的优点。在实际应用中,需要根据检测目的和样本情况选择合适的检测方法。RT-qPCR技术原理RNA提取从样本中分离和纯化高质量的totalRNA，为后续反应奠定基础。反转录利用反转录酶将RNA转化为互补DNA(cDNA)。实时荧光定量PCR通过实时监测荧光信号的增强来定量检测目标基因的表达水平。结果分析利用专业软件对实验数据进行统计分析和可视化处理。实验设计与流程1合理设计根据研究目标和实验假设确定实验设计2样本准备小心采集和保存生物样本3RNA提取从样本中提取优质的总RNA4cDNA合成进行逆转录反应获得cDNA实验设计和流程是成功进行microRNA定量检测的关键步骤。首先根据研究目标合理设计实验方案。然后仔细准备生物样本并提取高质量的总RNA。接下来进行逆转录反应,将RNA转换为可用的cDNA模板。后续的实验步骤包括引物设计、反应条件优化等。引物设计要求序列长度引物长度一般为18-25个碱基,能提供足够的专一性而不过长。熔点温度引物的熔点温度控制在55-65℃为佳,便于PCR反应进行。序列组成引物应尽量避免含有二次结构或self-dimer,防止影响扩增反应。专一性引物应只针对目标microRNA序列,不与其他microRNA发生交叉反应。RNA样品制备注意事项样品采集对于生物样品,需要确保采集时间一致,避免样品的任何污染或降解。样品保存立即将样品置于液氮或干冰中保存,长期保存需要-80℃超低温冰箱。样品前处理在提取RNA之前,需要进行均质化和细胞裂解,保证足量高质量的RNA。RNA提取方法选择适合样品类型的RNA提取试剂盒,遵循标准操作流程以获得纯度高的RNA。RT反应优化策略选择合适的引物针对目标microRNA设计特异性强、能可靠扩增的引物非常重要。选择3端富含A/U序列的引物更有利于反应进行。合理设置起始量根据目标microRNA的表达水平，采用合适的总RNA量进行反转录。适当提高起始量可以增加检测灵敏度。优化反应体系适当调节反应体系中Mg2+、dNTP浓度和反应缓冲液种类等参数,有助于提升反转录效率。选择合适的酶不同种类的反转录