实验四细胞色素C的制备及含量测定.pdfVIP

生物制药技术实验

第4单元（节），4学时，授课时间2010年11月24日，地点202

项目主题：实验四细胞色素C的制备及含量测定：

能力目标

掌握细胞色素C的制备及含量测定的基本知识

知识目标：

掌握细胞色素C的制备及含量测定原理和操作。

重点难点与解决方案：

细胞色素C的制备演示解决

，

教材、参考资料与媒体：

自编教材，参考网络上的一些相关知识

教学条件（环境）：100分钟讲授，30分钟演示、110分钟巡回指导和学生

操作

一、实验目的

掌握细胞色素C的制备方法和它的基本原理。

二、实验原理

细胞色素是一类含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，它是细胞体内膜上呼吸链中重要

的电子传递体，只存在于需氧细胞中。需氧多的如心肌及酵母等细胞中含量丰富。细胞

色素C是细胞色素的一种。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许

多来源获得细胞色素C结晶，并已对40多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。

结果表明，细胞色素C的氨基酸残基的数目为103～111，不同来源的细胞色素C的氨基

酸残基的顺序及含量都有一定差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高，等电点为10.7，含

铁量为0.38～0.43%，分子量为12，000～13，000。

细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，帮常用酸性水提取。

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C分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。

细胞色素C对热较稳定，不易变性。在PH7.2～10.2，100℃加热3分钟，细胞色素C氧

化型和还原型变性程度也较稳定，可抵抗0.3mol/L盐酸和平共处0.1mol/L氢氧化钾溶液

和长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的，因此较稳定并易于保存。

细胞色素C的吸收光谱，氧化型细胞色素C最大吸收峰为408nm,530nm；还原型的

最大吸收峰为415nm,520nm和550nm。

常以含量较高的心肌和酵母等为材料进行分离制备。本实验以新鲜猪心为原料经过

酸溶液抽提。制品用分光光度法测定细胞色素C溶液的含量。

三、实验试剂

（

1）2mol/L硫酸

（2）1mol/L氢氧化铵

（3）人造沸石：为白色颗粒，不溶于水，溶于酸。选用60～80目。

再行方法：使用过的沸石，先用自来水洗去硫酸铵，再用0.2～0.3mol/L氢氧化钠和1mol/L

氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，最后用水反复洗至PH7.0－8.0,即可重新使用。

（4）0.2%氯化钠溶液

（5）25%硫酸铵溶液

（6）20%三氯乙酸

（10）10%乙酸钡溶液

（11）0.06mol/L磷酸氢二钠－0.4mol/L氯化钠溶液：称取21.5g磷酸氢二钠，23.4g氯化

钠，加水溶解，定容至100ml

（12）标准细胞色素C溶液（80mg/ml）

(13)连二亚硫酸钠

（14）1mol/L乙酸

（15）0.02mol/L磷酸二氢钾溶液

四、实验器材

（1）部分收集器

（2）离心机

（3）色谱柱

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4）透析袋

（5）尼龙纱布

（6）可见分光光度计

五、操作

1、提取：

称取100g猪心肌肉糜，加水200ml，用2mol/LHSO调PH至4.0，在室温下搅拌提取1

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小时，用1mol/L氢氧化铵调PH至6.0,离心3000r/min，10min，收集上清液。

2、吸咐及洗脱：

用1mol/L氢氧化铵将上述提取液调PH至7.2，静置20～30min，收集上层澄清液，

将下层悬浮液，离心3000r/min,10min,取下清液与前面的液体混合，待上柱。

把人造沸石装入层析柱，约12～15cm。

将提取液上柱，通过人造沸石进行吸附，流速约为