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离子交换柱层析操作规程

（可溶性蛋白）

1.装柱：

1.1取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；

1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；

1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，

1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；

2.柱的平衡与上样：

2.1用0.02MTBbufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6；

2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；

3洗杂蛋白：

3.1用0.02MTBbufferA缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋

白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS检测；

3.2用含10mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出

液与含10mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

3.3用含20mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出

液与含20mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

3.4用含40mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出

液与含40mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

3.5用含60mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出

液与含60mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

3.6用含80mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出

液与含80mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

3.2用含100mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流

出液与含100mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）

4解离目的蛋白：

4.1用含100mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流

出液与含100mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

4.2用含200mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流

出液与含200mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

4.3用含500mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流

出液与含500mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做

SDS检测；

4.4用含1000mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流

出液与含1000mMNaCL的TBbufferA缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul

做SDS检测；

（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）

5.柱的清洗与保存：

5.1用含1000mMNaCL的TBbufferA缓冲液（PH7.6）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；

5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；

5.3用过滤去离子水冲洗50ml；

5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。