第二章基因工程制药新版7.pptx

第三节基因工程制药生产的基本过程;十、变性蛋白的复性

;以大肠杆菌作为表达系统生产基因工程药物时,药物蛋白通常会形成无活性的蛋白聚体即包含体,它们的一级结构即氨基酸序列是正确的,但空间结构错误,没有生物学活性。需要一个复性过程才能得到生物活性蛋白。;包含体是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所包围。细胞破碎后,包含体呈颗粒状,致密,低速离心就可获得。欲获得天然活性态的目标产物,必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。;包含体的优势：

1、富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势；

2、抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；

3、对宿主毒性小：生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。;一、包含体及包含体形成原因;包含体的组成与特性：

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，无定形，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。;二、包含体的分离和溶解;1、包含体的分离

收集重组菌，破碎细胞；离心除上清；使用变性剂洗涤沉淀。

2、包含体的溶解

打断包含体蛋白分子内和分子间的各种化学键，使多肽链伸展。;溶解采用强的变性剂，如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，SDS，各种溶解方法都各有利弊。

含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。

加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。;三、包含体蛋白复性方法

;1稀释、透析复性法

2含二硫键的蛋白复性

3封闭蛋白的疏水簇促进复性

4凝胶过滤层析复性

5小分子添加剂促进复性

6分子伴侣或折叠酶促进的复性

7人工分子伴侣促进的复性

8减缓蛋白合成速率

;1稀释、透析复性法

;2含二硫键的蛋白复性;3封闭蛋白的疏水簇促进复性

;4凝胶过滤层析复性

;5小分子添加剂促进复性

;6分子伴侣或折叠酶促进的复性

;7人工分子伴侣促进的复性;8减缓蛋白合成速率;十一、基因工程药物的质量控制;（一）原材料的质量控制;（二）培养过程的质量控制标准;（三）纯化过程中的质量控制;（四）目的产品的质量控制;1、产品鉴别的定性分析;（1）肽图分析;（2）氨基酸成份分析;（3）部份氨基酸序列分析;3.2氨基酸组成及顺序分析;各类氨基酸自动测序仪;（4）重组蛋白质浓度、相对分子量测定;电泳法测定未知蛋白的分子量;（5）蛋白质二硫键分析;2、纯度分析;Isoelectricfocusing;3、杂质检测;（1）蛋白质杂质的主要来源;（2）非蛋白质杂质主要类别;（3）常见的杂质和污染物、以及检测方法;4、生物活性测定;5、稳定性考察;6、产品一致性保证;7、产品的安全性;（五）：产品的保存要求;1、液态保存;（4）真空保存蛋白质在真空状态、或者在惰性气体中密闭保存，能抵抗氧化作用。

（5）保护剂保存：

（A）某些蛋白质在疏水环境中能够长期保存，这类稳定剂有糖类、脂肪、蛋白质类、多元醇、有机溶剂。

（B）某些蛋白质在高离子强度的极性环境中能长期保存，这类稳定剂有中性盐类。

（C）某些蛋白质由于含有半胱氨酸的巯基，容易被氧化，形成次磺酸、和二硫化物，这类稳定剂有2-巯基乙醇、二硫苏糖醇。

;2、固态保存--冻干粉保存、结晶保存;十二、基因工程药物的制造实例

;（一）干扰素α-2b

;1、基因工程菌的组建;(1)步骤;（2）流程图;[A]上游工艺流程;[B]下游工艺流程;人干扰素α-2b的基因工程菌为SW-IFNα-2b/E.coli—DH5α。

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基因工程菌接种到4个1000ml三角烧瓶中，每个烧瓶内装有250ml种子培养基，30℃培养10小时，作为发酵罐的种子。

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用15L发酵罐进行发酵，装发酵培养基10L

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搅拌转速500r/min、通气量为1：1v/v*min、溶氧量为50%

30℃发酵8小时（细菌增殖阶段）

42℃诱导2-3小时（产物生产阶段）

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[监控手段：每隔不同时间，取2毫升发酵液，10000r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。];3、干扰素的制备;4、质量控制标准和具体要求;（1）半成品检定--13项指标;5、相对分子量测定:用还原型SDS法，加样不低于5g，用已知分子量蛋白质作对照，迁移率为横坐标、相对分子量的对数作纵坐标，计算相对分子量，其误差不得高于10%。

6、残余外源性DNA含量测定:用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中的残余外源性DNA应低于100pg。

7、残余血清IgG含量测定:用酶标免疫测定法，每剂量（20μg）的鼠IgG含量