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非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法

1、范围

本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。

本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

2、规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489?实验室生物安全通用要求

NY/T541?兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3、试剂

3.1?DNA提取试剂

DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。

3.2?2×PCR缓冲液

2?×?PCR缓冲液的配制见附录A。

3.3?引物探针

3.3.1?采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：

上游引物ASF-CADC-rPCRF：5-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3

下游引物ASF-CADC-rPCRR：5-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3

荧光探针ASF-CADC-Probe：5-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3

3.3.2?可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals）第2.8.1章AfricanSwineFever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：

上游引物ASF-OIE-rPCRF：5-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3

下游引物ASF-OIE-rPCRR：

5-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3

荧光探针ASF-OIE-Probe：

5-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3

3.3.3?使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。

3.4?阴性及阳性对照

阴性及阳性对照的制备方法见附录C。

3.5?其他试剂

消毒液、5U/μLTaqDNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/LPBS（pH7.2）。

消毒液配制见附录A，0.01mol/LPBS配制见附录A。

4、仪器和耗材

分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2?μL，20?μL，200μL，1000?μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。

5、操作步骤

5.1?样品采集及运输

样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。

5.2?样品处理

检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/LPBS（pH7.2）制成匀浆，经10000r/min离心取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。

5.3?样品保存

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

5.4?病毒DNA提取

5.4.1?DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。

5.4.2?待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5mL离心管，逐管编号。

5.4.3?每管加入200μLDNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13000r/min离心10min。DNA提取液1见附录A。

5.4.4?尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10?μLDNA提取液2，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，2000r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。

5.4.5?100℃干浴或沸水浴10min。

5.4.6?加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13000r/min离心10min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的