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百川东到海，何时复西归?少壮不努力，老大徒伤悲。——汉乐府
实验十一鸡大肠杆菌灭活疫苗的制备和检验
细菌性灭活疫苗制备的基本程序为菌种的选择和种子的生产、菌
液培养、灭活、配苗和分装，在此过程中还包括菌种、半成品以及成
品检验。
大量生产的细菌培养方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、
液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。灭活菌苗通常根
据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行。灭
活疫苗的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。鸡大肠杆菌灭活菌通
常采用司盘白油佐剂，经过乳化而成。
一、目的要求
1、了解细菌性灭活疫苗制造和检验的基本原理和过程。
2、掌握种子的生产、菌液培养、灭活、配苗和半成品以及成
品检验方法。
二、材料与试剂
1．材料
(1)菌种：鸡大肠杆菌灭活疫苗菌种或临床分离株。
(2)实验动物：1～4月龄健康鸡。
(3)主要器材：超净工作台、恒温培养箱、冰箱、摇床、胶体
磨、压盖机、高压锅、显微镜、酒精灯、温度计、普通试管、三角瓶、
平皿、1ml注射器、疫苗瓶、瓶盖、记号笔和SPF鸡隔离箱等。
2．试剂蛋白胨营养琼脂培养基、普通肉汤培养基、甲醛溶液、
百川东到海，何时复西归?少壮不努力，老大徒伤悲。——汉乐府
鉴别培养基、甲醛溶液、佐剂等。
三、实验内容
1、大肠杆菌培养与细菌的灭活。
2、大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的配制。
3、大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的成品检验方法。
四、操作步骤
1．大肠杆菌茵液培养
(1)种子液：将大肠杆菌菌种或临床分离株，分别于普通肉汤培
养基中，置36～37℃保温18～24h，经纯检验后作为种子液。
(2)细菌培养：将种子液接于蛋白胨营养琼脂培养基表面，36～
37℃保温24h。加适量灭菌生理盐水将细菌洗下，装入玻瓶中，充分
振荡菌液，使细菌分散开。
(3)纯检：将培养的细菌菌液接种于琼脂培养基表面，36～37℃
保温24h。观察菌落大小，应均匀一致。
(4)细菌计数：用麦氏比浊管法测定菌数或用平板计数，将菌数
调整为15亿个／ml。
2．细茵灭活按菌液体积加入终浓度为O．3％的甲醛溶液，于37℃
温箱中灭活24h，其振荡数次。灭活后取少量菌液，接种于普通营养
琼脂平板，37℃培养24～48h，进行灭活检验。菌液灭活后应无菌生
长。
3．配苗
（1)油苗
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①油相准备：白油94份，硬脂酸铝2份，加热使硬脂酸铝溶化
后，加司本一806份，110℃加热30min。
②水相准备：菌液96份，吐温一804份，充分振荡，使吐温完
全溶解。
③乳化：加入油相1份，开动胶体磨，慢速转动，徐徐加入水相
l份，7000～10000r／min离心5min。
（2)铝胶苗
将灭菌好的铝胶按20%加入菌液，震荡均匀即可。
4．成品检验
(1)无菌检验：将成品直接接种T．G小管、G．A斜面或适于本
菌生长的融他培养基各2支，每支0.2ml，1支置37℃培养，1支置25℃
培养。另取0.2
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