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外周血染色体标本制作

一、染色体标本制备原理在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离解胞间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而又能清楚地显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获的细胞作一系列预处理。有时，在对细胞进行固定的时候，为了使固定剂迅速渗透到组织中，以便于研究染色体的特殊结构，也需要作预处理；其目的是使细胞的核外条件及染色体本身的状态更适于分析和研究的需要。在细胞培养（培养基中加有PHA）后72小时，合成DNA的细胞占总数的45％，有丝分裂的速率相当于每小时1%，被激活的淋巴细胞占总数的90%，是收获分裂期细胞、制备染色体标本的最佳时期。从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、低渗处理、固定、滴片等几个主要环节，现将各步骤的原理、所用试剂及相关注意事项详述如下。

1纺锤体抑制剂1.1基本原理和机制使染色体散开并清楚地呈现次缢痕，凭借的原理是改变细胞质的粘度。因为在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。纺锤体的形成取决于细胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡。因此，改变细胞质的粘度就能破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，或者更确切地说，染色体不再粘附至细胞内的任何结合力上。所以在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很易铺展开来。同时，由于染色体的不同区段上水合作用的能力不一，当细胞质的粘度发生变化时，就会使缢痕区显示得更为清楚。

1纺锤体抑制剂细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁由13条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋白，而微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种。α微管蛋白和β微管蛋白组成的异二聚体构成微管亚单位，若干个异二聚体相接连成原丝。α微管蛋白与β微管蛋白在化学结构上极为相似，两者42%序列相同。其中β微管蛋白肽链中第201位为半胱氨酸，为秋水仙素结合部位。如果结合的部位被其结合，微管不仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。

1纺锤体抑制剂故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺锤体抑制剂能引起有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺锤体的形成，但不影响染色体的复制和着丝粒的分裂使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素积累分裂中期的作用，几乎对所有植物器官和许多动物的器官都是十分有效的。

1纺锤体抑制剂1.2主要的纺锤体抑制剂及其作用特点秋水仙素秋水仙素（colchicine）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（Colchicumautumnale）中提取出来，故名。分子式C22H25O6N。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157℃。易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。

1纺锤体抑制剂1.3处理过程培养终止前在培养基中加入浓度为20μg/ml的秋水仙素0.05~0.1ml（1ml注射器滴垂直3-5滴）使其最终浓度为0.4~0.8μg/ml，置5%CO2、37oC±0.5oC培养箱中处理2~4h。

1纺锤体抑制剂1.4注意事项应当注意的是经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液(金属固定液或非金属固定液)予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织或细胞上冲洗掉，否则沉积在细胞表面的秋水仙素不仅会影响染色体的形态，而且还会阻碍固定液的穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早地加快速穿透液，如甲醇—冰醋酸固定液。要不然在固定的时候，细胞核仍可能进入代谢期。

2低渗溶液经过秋水仙素处理后，细胞内的染色体比较适合于观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞的染色体数目多，形状小，最大的染色体约7—8微米，加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平面上。这些均有赖于低渗处理。

2低渗溶液2.1基本原理和机制1965徐道觉发现未作低渗处理时，伴随染色体的一些零乱的物质类似于核糖核蛋白体的颗粒，显然是有丝分裂中核仁崩溃时的残存物。而低渗处理后，这些物质就消失了。可见，低渗处理不只是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，而且还可使粘附于染色体的核仁物质散开，这样就能看清楚每一个扭曲的染色体。现在知道，覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散。

2低渗溶液2.2主要的低渗液低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾(0.65mol