克隆抗体制备技术.ppt

*****第六讲单克隆抗体制备技术单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇的抗体。011975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。02（一）单克隆抗体的概念免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强，亲和力大，滴度高的特异性抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞经无性繁殖而来的细胞群产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲和性也一致。12单抗与多抗的不同项目常规免疫血清抗体McAb抗体产生细胞多克隆性单克隆性抗体的结合力特异性识别多种抗原决定簇特异性识别单一抗原决定簇免疫球蛋白类别及亚类不均一性，质地混杂同一类属，质地纯一特异性与亲和力批与批之间不同特异性高，抗体均一有效抗体含量低高用于常规免疫学实验可用单抗组合应用沉淀反应容易形成一般难形成表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体致敏淋巴细胞的准备骨髓瘤细胞的准备细胞融合选择性培养单克隆抗体的制取抗体分泌细胞的筛选克隆化过程单克隆抗体制备过程抗原致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞融合选择性培养抗体分泌细胞筛选克隆化单抗制取单抗纯化单抗鉴定动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式——体内、体外剂量——0.5-100?g次数——视抗原而定间隔——视抗原而定佐剂——视抗原而定收集时间：末次接种后72h致敏淋巴细胞的准备0102细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT缺陷状态HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶骨髓瘤细胞的准备0102方式：物理、化学、生物PEG融合要点：（见图）细胞融合骨髓瘤细胞致敏淋巴细胞离心1000rpm10min50%PEG1ml培养液10ml离心1000rpm7min37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内21随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理选择性培养010203040506细胞组合HGPRT生长状态淋巴细胞+骨髓瘤+长期生长淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长骨髓瘤+骨髓瘤—不能生长未融合淋巴细胞+短期生长未融合骨髓瘤—不能生长随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理核苷酸从头合成途径（denovosynthesis）核苷酸补救合成途径（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）对筛选方法的要求：01多——大量样品一次检测02快——迅速取得检测结果03准——检测结果可靠性高04灵——检测方法灵敏度高05常用筛选方法：06ELISA、IFA等07抗体分泌细胞的筛选概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞克隆化过程有限稀释法102/ml10/ml计数103/ml2/孔制取方式：01体外——培养罐法02体内——腹腔接种03纯化：04盐析、层析、制备型HPLC05鉴定：06特征鉴定——Ig类型、亲和力、效价、特异性07决定簇鉴定——是否针对同一决定簇08单克隆抗体的制取多抗与单抗制剂的比较多抗单抗单抗