基因操作中大分子的分离和分析.pptVIP

0102第二节RNA的分离、检测和纯化第四章基因操作中大分子的分离和分析除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附RNase吸附剂）。为了进一步防范RNA降解，一般在RNA样品和RNA反应中加入RNA酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘RNase抑制剂。0201RNA酶抑制剂的使用吸入1.5mL离心管中，加入氯仿(0.2mL/mLTrizol)，冰上放置5min。000×g离心15min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水溶解。把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上放置5min。000×g离心10min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10min。01020304组织RNA的提取：RNeasy试剂盒是由Qiagen公司设计01其设计思路与DNA的分离纯化思路相似含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。02硅胶膜纯化法三、mRNA的纯化mRNA的纯化主要是针对真核生物而言的由于真核生物mRNA的3‘端有一个poly（A）尾可用亲和层析的方法纯化01有许多类型的商业化层析柱可用于mRNA的纯化。02聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸，如小分子量RNA寡核苷酸、DNA序列分析等。其变性条件可用加热方式，或使用尿素等变性剂。聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA分析和DNA分析的原理是类似的。不同的是，RNA分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛，也可使用氢氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亚砜（DMSO）。TotalRNA第三节分子杂交01第四章基因操作中大分子的分离和分析02Southern杂交01Northern杂交02Western杂交03DNA杂交探针为DNA或RNA当目标DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，01在0.4NNaOH碱性条件下变性，02再在1.5MNaCl/1MTris（pH7.4）条件下中和使DNA仍保持单链状态。03然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。04最后通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上05转膜杂交将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。分子杂交第四章基因操作中大分子的分离和分析第一节DNA的分离、检测和纯化一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化碱裂解法提取E.coli质粒DNA通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA质粒提取01仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅02材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌03试剂：LB培养基（液体、固体）溶液I 溶液II 溶液III TE(pH8.0)接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中?370C，190rpm振荡培养过夜?取1.5ml菌液入1.5ml的离心管中?6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体?100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min?加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体0112000rpm，离心15min02?03沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）04?0512000rpm，离心10min06?07晾干沉淀08?09沉淀用20ulTE溶解，-200C保存二、电泳检测010203DNA的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺电泳脉冲场凝胶电泳不同构型DNA的移动速度依次为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的