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WesternBlotting操作流程酸谈

蛋白免疫印迹（WesternBlotting）是将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到NC膜或PVDF膜上，然后用特异

性抗体检测某特定蛋白的一种蛋白质检测技术。

细胞或组织蛋白抽提电泳分离蛋白质转膜、抗体杂交显影

样品SDS电泳转膜封闭与抗体孵育化学发光图像分析

1.样品

裂解

细胞：弃培养上清，无菌PBS1-2遍，加入细胞裂解液（80-100ul/60mmdish）和蛋白酶抑制

剂，置摇摇动裂解，注意随时观察。

组织：将组织块切割成合适大小，无菌PBS漂洗1-2遍，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，高速匀浆

机匀浆或组织破碎仪破碎

去除碎片：4℃下12000rpm离心10-20min，取上清

蛋白定量：BCA法测定蛋白浓度后分装蛋白变性：加loadingbuffer，沸水浴煮5min。

BCA法标曲制作：

猫大同款碧云天，Western及IP细胞裂解液（P0013）BSA（ul）0123456

Pierce™BCAProteinAssayKit（23227）HO（ul）20191817161514

2

Sigma，SampleBuffer,Laemmli2×Concentrate（S3401）

2.SDS胶制作及电泳分离

玻璃板有不同规格的，能不同厚度的PAGE

灌胶

胶，注意选择合适的制胶玻璃板。制胶前使用洗涤

制胶支架剂充分洗净玻璃板和制胶梳子，去离子水冲洗数遍，

自然晾干，注意不要有水渍。

注意制胶支架松紧度以及制胶固定架上的上

的弹簧的弹性，灌胶时要时刻注意是否漏胶，如果

稍有些漏，可以在固定架上卡一个1ml枪头。

PAGE胶分两层，先配下层的分离胶，使用500ul

制胶固定架

无水乙醇将胶压齐，待分离胶凝固后，倒掉无水乙

醇，待乙醇挥发后，灌进去离子水一下残余的

乙醇，再配上层的积层胶。

积层胶液灌进去后立即插梳子，否则上样孔容易

制胶梳子

变形。制胶梳子也有不同规格，适用于不同厚度

的胶和上样体积。

2.SDS胶制作及电泳分离