creloxp基因敲除系统解读.ppt

cre_loxp基因敲除系统解读

背景介绍

年等首次在体

1981Evans1985年Smithies最早在哺乳动物

外分离和培养ES，成功建细胞中发现并实现了同源重组

立了小鼠胚胎干细胞系

一、Cre/Loxp系统

nCre重组酶（37℃）

Ø位点特异性重组酶，介导loxp

位点间的序列同源重组

Ø70%重组率，无需辅助因子，多种

P1噬菌体

结构的DNA底物

nLoxpsite

Ø34bp反向重复序列

nFlp/Frt重组系统

（1）重组方式

（2）基因敲除机理

Offspring：50%heterozygousknockoutafter1generation

基因敲除机理（续）

Offspring:25%homozygousknockoutafter2generation

二、基因敲除的基本流程

（1）打靶载体构建

Attention:

Exon1

3N

GT/AG

ConditionalKnockout

（2）转化ES细胞

电转需要的细胞数量2-5x107

电穿孔或是显微注射方法将构

建好的打靶载体导入ES细胞

（3）阳性克隆筛选

Ø随机整合

Ø定点整合

Ø没有整合

DTA(白喉毒素A亚基）

（4）囊胚注射

小鼠的遗传背

景取决于ES和

囊胚细胞

（5）嵌合体小鼠

（6）品系纯化

纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种

Loxp2小鼠品系建立完成

三、Cre工具鼠的构建

DNA显微原核注射，是指将外源DNA通

过显微注射的方法注射到受精卵的原

核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的

基因组中，并稳定遗传给后代。

诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建

MHC(cardiac-specifica-myosinheavychain)

Mer(mutatedmurineestrogenreceptorligand-bindingdomainamino

acids281to599,G525R)

D.S.Sohal,M.Nghiem.Temporallyregulatedandtissue-specificgenemanipulationsintheadult

andembryonicheartusingatamoxifen-inducibleCreprotein.CircRes.89:20-25(2001).

MerCreMer融合蛋白

该系统将雌激素受体(EstrogenReceptor,ER)的配

体结合区(ligand-bindingdomain,LBD)和Cre重组

酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重

组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从

而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产

生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组

酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其

不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌

激素后才能使其进入核内发挥作用。

TheEnd