实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定.ppt

酸性磷酸酶Km及Vmax值测定

清洗试管24支酸性磷酸酶：催化磷酸单酯的水解反应存在于人的肝脏，前列腺等处植物中以发芽的种子中含量最为丰富。是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。12一、概述酶液磷酸苯二钠苯酚＋磷酸氢二钠folin-酚测定酚的浓度计算出反应速度（用产物生成量/min来表示）根据双倒数法计算出Km及Vmax二、实验原理V=Vmax[S][S]Km+豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线制作酚标准曲线双倒数作图法计算Vmax和Km[S]与V0关系实验0102030405实验步骤：buffersubstrateenzymeCertainTimeblankStopthereactionColordeveloped01生化实验课老师：于晓虹03酶液稀释取上清液３００微升，稀释３０倍，用大试管装02实验报告请交到讲台上来04科代表李博恒上清液用pH5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。02称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。01磷酸酶原液的制备：01制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线02（目的：选取合适的反应时间）加液程序表管号1234560磷酸苯二钠0.50.50.50.50.50.50.5酶液0.50.50.50.50.50.5精确反应时间3510152025碳酸钠溶液2222222酶液－－－－－－0.5Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5Folin－酚溶液已稀释好！注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始35℃保温10分钟结果：以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。0123456反应时间03510152025吸光度制作酚标准曲线（目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟产物生成量来表示）0123456780.4mMphenol

standardsolution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21MNa2CO3222222222Folin-phenolreagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加液程序表35℃保温10分钟结果：以酚含量（μmol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线。以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度（A680nm）。012345678酚含量/μmol00.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度