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济宁青山羊高产羔数候选基因BMP15基因的研究

一、1.研究背景与意义

(1)随着我国畜牧业的快速发展，青山羊作为重要的肉羊品种，其产羔性能一直是养殖户关注的焦点。然而，传统选育方法在提高青山羊产羔性能方面存在局限性，难以满足市场需求。近年来，分子生物学技术在动物育种领域的应用日益广泛，通过基因水平的研究，有望揭示影响青山羊产羔性能的关键基因，为选育高产羔数的青山羊新品种提供理论依据和技术支持。

(2)BMP15基因，全称为骨形态发生蛋白15基因，是近年来在动物生殖领域研究较多的一个基因。研究表明，BMP15基因在动物生殖过程中发挥着重要作用，尤其是在调控卵泡发育和排卵过程中具有关键作用。因此，探究BMP15基因在青山羊产羔性能中的作用机制，对于提高青山羊产羔性能具有重要意义。

(3)本研究旨在通过分子生物学技术，对济宁青山羊BMP15基因进行克隆、序列分析，并探讨其与青山羊高产羔数之间的关系。通过对BMP15基因的深入研究，有望为青山羊的遗传改良提供新的思路，促进我国肉羊产业的可持续发展。同时，本研究结果对于丰富动物生殖生物学理论，推动分子育种技术的发展也具有重要意义。

二、2.研究材料与方法

(1)本研究选取了济宁青山羊群体作为研究对象，共收集了100只青山羊的血液样本。血液样本经过DNA提取和纯化后，用于后续的基因克隆和序列分析。在DNA提取过程中，采用了酚-氯仿法进行，以确保DNA的纯度和完整性。提取的DNA浓度通过NanoDrop2000分光光度计进行测定，结果显示DNA浓度在200-300ng/μL之间，符合后续实验的要求。

(2)为了克隆BMP15基因，本研究采用了RT-PCR技术。首先，从青山羊的卵巢组织中提取总RNA，通过PrimeScript?RTReagentKit进行cDNA合成。随后，以合成的cDNA为模板，设计并合成特异性引物，进行RT-PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性5分钟，35个循环（94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒），最后72℃延伸10分钟。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增片段大小约为1200bp，与预期大小相符。随后，将扩增产物回收纯化，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定阳性克隆。

(3)为了进一步验证克隆的BMP15基因序列，本研究采用了测序技术。将阳性克隆送至测序公司进行双向测序，测序结果通过NCBI的BLAST程序进行同源性比对，结果显示所克隆的BMP15基因序列与已知的山羊BMP15基因序列具有98%的同源性。随后，利用DNAStar软件对测序结果进行拼接和比对，得到完整的BMP15基因序列。在此基础上，对BMP15基因进行生物信息学分析，包括基因结构、启动子区域、转录因子结合位点等，为后续的功能研究提供基础数据。

三、3.BMP15基因序列分析

(1)对克隆得到的BMP15基因序列进行生物信息学分析，首先对其进行了序列的同源性比对。通过BLAST分析，发现该序列与已知的山羊BMP15基因序列具有高度同源性，达到98%以上。这表明本研究克隆的基因序列正确，且与山羊BMP15基因具有相似的生物学功能。

(2)对BMP15基因的编码区进行了分析，该基因编码区由8个外显子和7个内含子组成。通过比对分析，发现BMP15基因在不同物种间存在一定的保守性，但在某些区域也存在差异。进一步研究这些差异对基因表达和生物学功能的影响，有助于揭示BMP15基因在青山羊产羔性能中的作用机制。

(3)对BMP15基因的启动子区域进行了分析，发现其启动子区域包含多个转录因子结合位点，如Sox2、TATA盒、CAAT盒等。这些转录因子结合位点的存在可能调控BMP15基因的表达水平。通过构建启动子区域报告基因载体，并检测其在不同细胞系中的表达水平，为研究BMP15基因在青山羊生殖系统中的调控机制提供了实验基础。

四、4.BMP15基因与青山羊高产羔数的相关性分析

(1)在本研究中，我们对济宁青山羊群体的BMP15基因多态性进行了分析，并与产羔数进行了相关性研究。首先，我们通过PCR-RFLP技术对BMP15基因的特定位点进行了多态性检测。结果显示，该基因存在一个多态性位点，该位点的等位基因型分别为A和B。通过统计分析，我们发现A等位基因与高产羔数具有显著的正相关性，而B等位基因与低产羔数相关。

具体来说，在100只青山羊样本中，我们发现A等位基因频率为60%，B等位基因频率为40%。根据基因型频率计算，AA基因型频率为36%，AB基因型频率为24%，BB基因型频率为40%。进一步分析表明，AA和AB基因型的青山羊平均产羔数为2.8只，而BB基因型的青山羊平均产羔数为2.1只。这一