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鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用[发明专利]

一、引言

(1)犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种高度传染性的病毒，主要感染犬科动物，严重时可导致死亡。CDV感染可分为经典型和变异型两种，其中经典型CDV的死亡率极高。目前，针对CDV的预防措施主要包括疫苗接种。然而，由于疫苗株与野毒株之间的基因差异，传统的检测方法在区分两者时存在一定的局限性。因此，开发一种能够准确鉴别CDV野毒株和疫苗株的方法对于疾病防控具有重要意义。

(2)在过去的几十年里，随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术及其衍生技术已成为检测病毒感染的重要手段。引物和探针作为PCR技术的核心组成部分，其设计是否合理直接影响到检测的灵敏度和特异性。本研究旨在设计一对针对CDV基因组的特异性引物和探针，通过PCR扩增和杂交检测，实现对CDV野毒株和疫苗株的准确鉴别。

(3)本研究首先对CDV野毒株和疫苗株的基因组序列进行比对分析，识别出两者之间的差异区域。在此基础上，设计了一对能够特异性扩增该差异区域的引物和探针。随后，通过体外扩增实验验证了引物和探针的特异性，并通过动物感染实验评估了该方法在实际检测中的应用效果。研究结果表明，该引物和探针组合能够有效地区分CDV野毒株和疫苗株，为CDV感染的诊断和防控提供了新的技术手段。

二、引物与探针设计

(1)在设计引物与探针的过程中，首先对CDV野毒株和疫苗株的基因组序列进行了详细的比对分析，以确定两者之间的差异区域。通过生物信息学软件，对差异区域的核苷酸序列进行了优化，以确保引物和探针的特异性。针对CDV野毒株和疫苗株在基因序列上的显著差异，设计了一对特异性引物，其序列能够在野毒株特异性扩增，而疫苗株中则不产生扩增产物。

(2)探针的设计同样遵循了特异性原则，其序列与引物互补，能够与目标DNA片段形成稳定的杂交。在探针的设计过程中，特别注意了Tm值（熔解温度）的优化，以确保探针在PCR反应中具有良好的稳定性。通过对比实验，验证了所设计的探针在野毒株和疫苗株检测中的灵敏度，并确保其在实际应用中具有良好的可靠性。

(3)引物和探针的合成采用高纯度合成技术，以减少非特异性扩增和假阳性的发生。在实验验证阶段，对引物和探针的组合进行了优化，包括最佳反应条件、扩增效率和特异性等。最终确定的引物和探针组合在PCR反应中表现出良好的扩增效果，为后续的CDV野毒株和疫苗株的鉴别提供了可靠的分子生物学工具。

三、实验材料与方法

(1)实验材料包括CDV野毒株和疫苗株的DNA样本，用于PCR扩增和杂交检测。此外，实验中还使用了PCR反应试剂盒、DNA提取试剂盒、引物和探针、DNA标记染料、凝胶成像系统等。所有试剂均按照产品说明书进行操作，确保实验结果的准确性。

(2)实验方法主要包括以下步骤：首先，采用DNA提取试剂盒从CDV野毒株和疫苗株样本中提取DNA。然后，利用PCR反应试剂盒进行PCR扩增，包括预变性、变性、退火和延伸等步骤。在PCR反应中，使用设计的特异性引物和探针进行扩增，以检测CDV野毒株和疫苗株的差异。扩增结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。

(3)为了验证引物和探针的特异性，进行了以下实验：首先，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增带。其次，通过凝胶成像系统观察电泳结果，分析扩增产物的大小和数量。接着，将PCR产物进行测序，以验证扩增产物与预期序列的一致性。最后，通过将PCR产物与已知CDV野毒株和疫苗株的DNA进行杂交实验，进一步验证引物和探针的特异性。实验结果证实了所设计的引物和探针能够有效地区分CDV野毒株和疫苗株。

四、结果与分析

(1)实验中，采用所设计的引物和探针对CDV野毒株和疫苗株的DNA样本进行了PCR扩增。结果显示，在野毒株样本中，PCR扩增产生了预期的特异性条带，而在疫苗株样本中，未观察到扩增产物。通过凝胶成像系统分析，野毒株样本的扩增条带亮度强于疫苗株样本，表明PCR扩增具有较好的灵敏度。

(2)为了进一步验证引物和探针的特异性，我们将PCR扩增产物进行了测序。测序结果显示，扩增产物与预期序列高度一致，证实了引物和探针的特异性。此外，我们还对PCR扩增产物进行了杂交实验。在杂交实验中，野毒株样本的PCR产物与CDV野毒株特异性探针杂交，而疫苗株样本的PCR产物与疫苗株特异性探针杂交。这一结果表明，引物和探针能够有效地区分CDV野毒株和疫苗株。

(3)在实际应用中，我们选取了多个临床样本进行了实验。其中，20份来自犬瘟热病毒感染病例的样本，经过PCR检测，均显示出野毒株特异性扩增产物。而在20份健康犬的样本中，未观察到扩增产物。此外，我们还对10份已知的CDV疫苗株样本进行了检测，结果显示，这些样