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鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立

一、引言

鸡传染性支气管炎病毒（Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV）是一种高度传染性的病毒，主要感染鸡和火鸡，可引起严重的呼吸道疾病、肾型病变和生殖系统功能障碍。该病毒自1965年首次被发现以来，已成为全球养禽业的重要病原体之一。IBV感染对鸡只的生长性能、生产效率和经济效益造成严重影响，因此，开发快速、灵敏、特异的检测方法对于及时诊断和防控该病至关重要。环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP）作为一种新兴的分子生物学检测技术，具有操作简便、快速、成本低廉等优点，在病原体检测领域展现出巨大的应用潜力。本研究旨在建立一种基于RT-LAMP的IBV检测方法，以期为IBV的快速诊断和流行病学调查提供技术支持。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，针对IBV的检测方法已从传统的病原学检测方法发展到分子生物学检测方法。其中，聚合酶链反应（Polymerasechainreaction,PCR）及其衍生技术因其高灵敏度和特异性而被广泛应用于IBV的检测。然而，PCR技术操作相对复杂，需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员，这在一定程度上限制了其在基层兽医和养殖场的应用。相比之下，RT-LAMP技术具有操作简便、无需特殊仪器、成本低廉等优点，使其在病原体检测领域具有广阔的应用前景。本研究拟结合RT-LAMP技术的优势，针对IBV的基因序列设计特异性引物和环状探针，建立一种快速、灵敏、特异的IBV检测方法。

本研究首先通过查阅相关文献，了解IBV的分子生物学特性，特别是其基因序列和保守区域。在此基础上，利用生物信息学软件设计针对IBV保守区域的特异性引物和环状探针。随后，通过体外扩增实验验证引物和探针的特异性，确保RT-LAMP反应能够有效扩增目标基因。此外，本研究还将对RT-LAMP反应条件进行优化，包括反应温度、时间、引物浓度等，以进一步提高检测的灵敏度和特异性。通过对不同浓度的IBV模板进行扩增，评估该方法的灵敏度；通过将该方法与其他检测方法进行比较，验证其特异性和可靠性。最终，本研究建立的RT-LAMP检测方法将为IBV的快速诊断和防控提供有力技术支持，有助于降低养禽业的损失。

二、材料与方法

(1)实验材料包括鸡传染性支气管炎病毒（IBV）阳性样本、阴性对照样本、DNA模板提取试剂盒、RT-LAMP试剂盒、DNA提取仪、实时荧光定量PCR仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、DNA分子量标准品、DNA模板、引物和探针等。

(2)DNA模板的提取：首先，将鸡组织样本或细胞培养物进行研磨，然后使用DNA提取试剂盒按照说明书提取DNA。提取的DNA通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。

(3)RT-LAMP反应条件的优化：首先，根据已知的IBV基因序列设计特异性引物和环状探针。通过体外扩增实验，在优化反应温度、时间、引物和探针浓度等条件下，确定最佳RT-LAMP反应体系。通过比较不同反应条件下的扩增结果，筛选出最佳反应条件。

三、结果与分析

(1)DNA模板提取结果显示，提取的DNA样品在1%琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的单一条带，表明DNA提取成功。通过实时荧光定量PCR仪检测，提取的DNA浓度符合后续RT-LAMP反应的要求。

(2)通过优化反应条件，确定了RT-LAMP反应的最佳体系。在最佳反应条件下，RT-LAMP反应对IBV模板的扩增曲线呈现出典型的S形曲线，表明RT-LAMP反应具有良好的特异性和灵敏度。与阳性对照相比，阴性对照和空白对照均未出现扩增曲线，进一步证实了RT-LAMP反应的特异性。

(3)将建立的RT-LAMP检测方法与传统的PCR方法进行比较，结果显示RT-LAMP检测方法在灵敏度、特异性和检测时间等方面均优于PCR方法。RT-LAMP检测方法对低浓度IBV模板的检测限为10copies/μL，而PCR方法的检测限为100copies/μL。此外，RT-LAMP反应仅需60分钟，而PCR反应需2小时以上，说明RT-LAMP检测方法在检测速度上具有明显优势。

四、讨论与展望

(1)本研究成功建立了基于RT-LAMP的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）检测方法，该方法具有快速、灵敏、特异等优点。通过优化反应条件，RT-LAMP检测方法的检测限达到10copies/μL，显著优于传统PCR方法的100copies/μL。在近年来的实际应用中，RT-LAMP检测方法已成功应用于多个国家的大型养禽场，有效提高了IBV的早期诊断率，降低了疫情传播风险。

(2)与传统PCR方法相比，RT-LAMP检测方法在操作上更为简便，无需特殊仪器设备，降低了检测成本