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马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株及其培育方法[发明专利]

一、背景技术

(1)马传染性贫血病（EquineInfectiousAnaemia，EIA）是一种由马传染性贫血病毒（EquineInfectiousAnaemiaVirus，EIAV）引起的急性、亚急性或慢性传染病。该病毒主要通过吸血昆虫如蚊子进行传播，也可通过输血、精液、胎盘等途径传播。马传染性贫血病对马匹的健康和繁殖造成严重影响，据统计，全球每年约有数百万头马匹感染此病。马传染性贫血病在全球范围内广泛流行，尤其在非洲、亚洲和拉丁美洲地区，对当地马匹养殖业造成了巨大的经济损失。

(2)马传染性贫血病的主要症状包括发热、贫血、消瘦、食欲不振、呼吸困难等。严重病例可能导致死亡。由于目前尚无特效药物治疗马传染性贫血病，因此疫苗接种成为预防该病的重要手段。然而，现有的马传染性贫血疫苗存在保护效果不理想、免疫持久性差等问题。此外，疫苗生产过程中可能存在生物安全风险，因此开发安全、高效的疫苗对于控制马传染性贫血病具有重要意义。

(3)近年来，随着分子生物学和生物技术的发展，利用驴胎皮肤细胞作为疫苗生产载体逐渐成为研究热点。驴胎皮肤细胞具有以下优势：生长速度快、易于培养、病毒复制能力强、免疫原性好等。已有研究表明，利用驴胎皮肤细胞生产的马传染性贫血病疫苗在动物实验中表现出良好的免疫保护效果。然而，目前关于马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株的培育方法及其应用研究尚不充分，需要进一步探索和优化。

二、发明内容

(1)本发明提供一种马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株，该疫苗株能够有效预防马传染性贫血病，具有保护率高、免疫持久性好、安全性高等特点。通过采用驴胎皮肤细胞作为病毒繁殖和减毒的平台，成功获得了马传染性贫血病毒弱毒株，并在实验室条件下进行多次传代培养，保证了疫苗株的稳定性和有效性。

(2)与现有技术相比，本发明的马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株具有显著优势。首先，疫苗株的制备过程更加安全，降低了生物安全风险。其次，疫苗株的免疫原性强，能够诱导马匹产生高水平的特异性抗体，有效保护马匹免受马传染性贫血病毒的感染。例如，在动物实验中，接种本发明疫苗株的马匹血清抗体滴度达到1:1600，显示出良好的免疫保护效果。

(3)本发明所述的培育方法包括病毒接种、驴胎皮肤细胞培养、病毒分离和纯化等步骤。通过优化病毒接种量和接种频率，以及调整驴胎皮肤细胞的培养条件，成功实现了马传染性贫血病毒在驴胎皮肤细胞中的高效复制和减毒。实验结果表明，采用本发明方法培育的疫苗株对马匹具有良好的免疫效果，能够有效降低马传染性贫血病的发病率和死亡率。

三、技术方案

(1)本发明涉及一种马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株的培育方法，首先采集健康驴胎皮肤组织，通过组织块培养获得驴胎皮肤细胞。接着，将马传染性贫血病毒接种于驴胎皮肤细胞中，在适宜的培养条件下进行病毒复制和减毒处理。通过连续多次传代培养，筛选出具有弱毒特性的疫苗株。

(2)在病毒分离和纯化过程中，采用分子生物学技术对病毒进行鉴定，确保疫苗株的纯度和特异性。同时，通过观察病毒感染细胞的形态变化、进行病毒滴度测定等方法，对疫苗株的病毒滴度进行优化。此外，对疫苗株进行生物安全性评估，确保其对人体和环境无害。

(3)成功获得马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株后，进一步研究其免疫效果。通过动物实验，评估疫苗株对马匹的保护效果，包括抗体产生水平、免疫持久性、攻毒保护率等指标。同时，对疫苗株进行临床试验，验证其在实际应用中的安全性和有效性。根据实验结果，对疫苗株的配方和接种方案进行优化，以实现最佳免疫效果。

四、实施方式

(1)实施本发明首先采集驴胎皮肤组织，将其切成小块，接种于预处理的驴胎皮肤细胞培养基中，在适宜的温湿度条件下进行组织块培养，直至细胞铺满培养瓶底部。随后，将马传染性贫血病毒接种于驴胎皮肤细胞中，确保病毒与细胞的充分接触和感染。

(2)接种病毒后，将培养瓶放置于二氧化碳培养箱中，定期观察细胞变化，记录病毒感染情况。在病毒感染过程中，通过调整接种剂量和培养时间，实现对病毒复制和减毒的控制。经过多次传代培养，筛选出病毒滴度适中、细胞形态稳定的弱毒疫苗株。

(3)筛选出的弱毒疫苗株进行纯化处理，包括细胞分离、病毒颗粒的收集和纯化。通过电镜观察、PCR鉴定等方法对疫苗株进行鉴定，确保其纯度和特异性。接着，进行动物实验，观察疫苗株对马匹的免疫保护效果。实验中，将疫苗株接种于马匹体内，通过抗体检测、攻毒保护实验等手段评估疫苗株的免疫效果。根据实验结果，进一步优化疫苗株的配方和接种方案。

五、有益效果

(1)本发明的马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株具有显著的有益效果。通过在驴胎皮肤细胞中培育出的疫苗株，其免疫保护