DB22T 3601-2023 人参锈腐病菌分子检测 实时荧光定量PCR法.docxVIP

ICS65.020.20CCSB16

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吉林省地方标准

DB22/T3601—2023

人参锈腐病菌分子检测实时荧光定量PCR法

DetectionofIlyonectriarobustacausingginsengrustyrootrotbyquantitativereal-timePCR

2023-12-28发布2024-02-01实施

吉林省市场监督管理厅发布

DB22/T3601—2023

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的

规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：吉林农业大学、吉林参王植保科技有限公司。

本文件主要起草人：陈长卿、姜云、高洁、徐怀友、卢宝慧、杨丽娜、姜伊琳。

DB22/T3601—2023

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人参锈腐病菌分子检测实时荧光定量PCR法

1范围

本文件确立了人参锈腐病菌实时荧光定量PCR分子检测方法，给出了实时荧光定量PCR检测原理，规定了试剂和材料、仪器设备、样品采集与制备、分析步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施。

本文件适用于人参根和土壤中锈腐病菌的实时荧光定量PCR分子检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T28067甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法

3术语和定义

GB/T28067界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

人参锈腐病ginsengrustyrootrot

一种主要由强壮土赤壳菌（Ilyonectriarobusta）侵染人参根部导致的土传病害。

实时荧光定量PCR法quantitativereal-timePCR

一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。[来源：GB/T28067—2011，2.3]

4原理

根据人参锈腐病强壮土赤壳菌I.robusta组蛋白Histone基因的保守序列设计一对特异性引物进行PCR扩增反应。利用荧光信号伴随目的PCR产物的增加而增强的原理，收集PCR扩增过程的荧光信号值。随着PCR扩增反应的进行，Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，根据Ct值判断供试样品是否含有人参锈腐病强壮土赤壳菌。

5试剂和材料

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DB22/T3601—2023

5.1通用要求

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

5.2试剂

5.2.1水，GB/T6682,一级。

5.2.2植物基因组DNA提取试剂盒。

5.2.3土壤总DNA提取试剂盒。

5.2.4实时荧光定量PCR试剂盒。

5.3引物

5.3.1引物序列

上游引物：5′-CCGCCGACCTGACCTGACCGTCCGCC-3′,下游引物：5′-ATGATGTTTGATGCGAGACGTAA-3′。

5.3.2引物配制

引物用水稀释成10μmol/L,-20℃保存备用。

6仪器设备

6.1天平：感量0.001g。

6.2实时荧光定量PCR仪：激发/检测波长范围350nm～750nm,可用荧光染料(SYBRGreenI);升降温速度≥3.0℃/s;均一性≤±0.5℃;准确性≤±0.3℃;温度范围4℃~100℃。

6.3高压灭菌锅：125kPa。

6.4离心机：离心转速12000rpm以上。

6.5冰箱：4℃,-20℃,-80℃。

6.6微量移液器：0.1μL～2.5μL,2μL～20μL,20μL～200μL,100μL～1000μL。

6.7核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.8恒温水浴锅。

6.9涡旋振荡器。

6.10粉碎机。

7样品

7.1对照样品

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