DB41T 1515-2017 猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS65.020.30B41

DB41

河南省地方标准DB41/T1515—2017

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法

2017-12-06发布2018-03-06

河南省质量技术监督局发布

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DB41/T1515—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局归口。

本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，郑州市畜牧技术推广站，焦作市动物疫病预防控制中心,驻马店市动物疫病预防控制中心、开封市动物卫生监督所、郑州市中心医院。

本标准主要起草人：崔沛、班付国、闫若潜、曹伟伟、马震原、陈悦、王淑娟。

本标准参加起草人：王英华、谢彩华、王翠、王华俊、赵胜杰、赵明军、王东方、郭育培、张敏、杨晴、张煜、刘先敏、靳冬、刘淑敏。

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DB41/T1515—2017

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法

1范围

规定了猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测的试剂和仪器设备,样品采集、处理、存及运输,操作方法、结果判定。

适用于对疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、血液，精液，流产胎儿、死胎、木乃伊胎等样品中病毒核酸的检测。

2试剂和仪器设备

2.1试剂

2.1.1除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂应使用无RNA酶污染的容器进行分装。

2.1.2组织悬液（见附录A），-20℃保存。

2.1.3裂解液（TriZol），氯仿，1×核酸电泳缓冲液，0.01mol/L（pH7.2）的PBS（见附录A），DEPC处理水（见附录A），以上试剂4℃保存。

2.1.4组织样品悬液常规试剂（见附录A）常温保存。

2.1.5裂解液（TriZol），氯仿，0.01mol/L（pH7.2）PBS（见附录A），DEPC水（二乙基焦碳酸酯处理的水），均应2℃-8℃保存。

2.1.6异丙醇，75%乙醇，应-20℃保存。

2.1.7阳性对照样品、阴性对照样品见附录A。

2.1.8RT-PCR扩增用上、下游引物序列见附录B。

2.1.9猪乙型脑炎病毒RT-PCR试验反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录C。2.2仪器设备

PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心转速在12000r?min-1以上），核酸电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，生物安全柜，组织匀浆器，2℃~8℃冰箱，-70℃冰箱，单道微量移液器（0.1μL～2.5μL；0.5μL～10μL；2μL～20μL；20μL～200μL；100μL～1000μL）凝胶成像系统(或紫外透射仪)，真空干燥器。

3样品的采集、处理、存放及运输

3.1样品的采集

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3.1.1采取疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎及公猪精液等靶组织样品，装入灭菌1.5mL离心管中，编号，送实验室。

3.2样品的处理

3.2.1组织样品处理：取100mg待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000r/min离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管中编号备用。

3.2.2血清样品的处理：用无菌注射器自耳静脉采集血液1-2mL，把血清析出后直接转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。

3.3存放与运输

采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。

4操作方法

4.1样品RNA的制备

4.1.1取1.5mL灭菌离心管，每管加入300μL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各100μL，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；再加入100μL氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于4℃条件下，12000r/min离心15min。

4.1.2吸取离心后各管中的上清液150μL转移至新的1.5mL灭菌离心管中（注意不要吸出中间层），加入150μL－20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min。

4.1.34℃条件下12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，