植物细胞的获取.pptVIP

一、植物原生质体的材料来源几乎能从植物的所有部位得到原生质体，其中以叶片为多，因为植物叶肉细胞的原生质体有下面几个优点：取材容易，植株可来自盆栽和温室栽培，也可在试管中培育无菌苗。原生质体在生理和遗传特性上比较一致。比较容易用酶解法分离。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。21原生质体也可以从组织培养的材料中大量获得。由于组织培养的严格条件，使得材料的重复性好，实验材料可做到常年供应。值得注意的是，在考虑分离植物原生质体时，既要采用容易获得原生质体的植物材料，但更重要的是要选用易于再生完整植株的细胞。二、植物原生质体的材料来源二.植物原生质体的分离和纯化生质体的分离早在1892年就有人用机械法分离原生质体。直到1960年，英国的科金(Cocking)首先采用酶解法分离原生质体。酶解法有下面几个优点：能获得大量的原生质体；条件温和，原生质体完整性好；原生质体纯净度高；下酶解：用镊子撕去叶子的下表皮后，切成2厘米见方的小片，使去表皮的一层朝下放入酶液中处理，在25-28℃，黑暗下酶解3-4hr。若采用悬浮培养的细胞，则采用继代3d的细胞最好，经离心收集细胞，放入酶液中置低速转床酶解8-12hr。材料准备与表面灭菌01020304酶解后纯化原生质体的步骤如下：将含有原生质体的酶液收集到离心管中，低速离心使原生质体沉于管底，倒掉上清液。重复上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生质体培养液洗涤一次。酶解悬浮液用400目的不锈钢或尼龙网过滤，以除去未消化的碎片。在离心管中加入适量的洗涤液，并离心。上述的离心纯化法可细分为：A．沉降法；B．漂浮法；C．沉降法和漂浮法结合等三种。0506(二)原生质体的纯化分离时酶的溶剂为原生质体培养基甘露醇和蔗糖为渗透压调节剂在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的稳定性原生质体培养基酶溶剂用原生质体培养基或特殊配制一是目测法：凭借形态可识别原生质体的存活性。二是采用特异的染色方法来确定：1%酚藏花红液染色，活的原生质体能吸收而呈红色，死的则无此能力；伊文思蓝与之相反，仅死原生质体可吸收；荧光素双醋酸酯(FDA)染色，FDA本身没有荧光和极性，可自由渗透进出完整质膜。活的原生质体的酯酶能分解FDA成为具有荧光的极性物质，无活力的不产生荧光。(三)原生质体的活力测定第二章植物细胞的获取01成功关键：培养基及培养条件、外植体的来源。02外植体的选择03从生长正常，无病虫害的母株中，选择适宜的组织器官04用于直接分离细胞的外植体的选择05原则：细胞之间粘连程度较小；06叶片最佳；07限制：机械或酶伤害细胞，完整细胞较少。第一节外植体的选择与预处理双子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、根等。单子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、细穗、花药等。无论是双子叶植物还是单子叶植物、均以幼胚诱导愈伤组织的为最佳。因为幼胚诱导的愈伤组织质量最好，分化能力强。基因型的影响：不同种类及不同品种之间存在差异；用于愈伤组织诱导的外植体的选择同一植物，不同部位脱分化和再分化能力存在差异：百合：外层＞内层；紫草根＞茎叶；苹果顶芽褐变程度＜侧芽；兰科：茎尖；还要考虑生产目的：选用植株中主要生产所需的的次级代谢产物的组织和器官取材季节：母株生长旺盛的季节；紫草：秋天（紫草宁合成和积累）；外植体大小：适当大小；脱毒率和茎尖大小及成活率之间的关系；外植体的生理状态：红豆杉：新生的嫩枝；用于愈伤组织诱导的外植体的选择用于分离原生质体的外植体的选择1分离原生质体则以叶片为最好。苗龄与叶龄有关；太老不易游离，太嫩，易游离，但细胞膜易损害；2以苗龄15－25d，刚展开的幼叶为最佳。3无菌苗幼叶；4还要考虑培养目的；5多数情况下，需要根据实验确定；604030102花粉材料的选择用作花粉培养的亲本植株的基因型、生长情况以及接种时花粉所处的发育时期，对花粉植株的诱导频率都有直接的影响。关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。花粉的发育时期四分体－－小孢子－－单核花粉－－双核花粉花药培养属于器官培养范畴花粉培养也称为小孢子培养。是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.属于细胞培养的范畴二、外植体的