化妆品修护功效评价-体外人源成纤维细胞迁移能力试验.docxVIP

T/ZHCAxxx—2022

化妆品修护功效体外测试方法人源成纤维细胞迁移能力试验

1范围

本文件规定了一种化妆品修护功效的体外测试方法。

本文件适用于采用人源成纤维细胞迁移能力试验评价化妆品及原料的修护功效。

2规范性引用文件

本文件没有规范性文件。

3术语及定义

3.1

成纤维细胞Fibroblast

普遍存在于疏松结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。

3.2

细胞迁移CellMigration

也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。

4试验原理

细胞迁移能力试验，也可以称为划痕试验、愈合试验，是当细胞长到融合成单层状态时，在单层细胞上人为划出一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。使用不同的物质处理细胞，对细胞产生影响，可能会产生促进细胞迁移的作用。

细胞迁移在体内的生理活动中包括了对微小伤口的愈合作用，这与化妆品淡化皮肤纹理、促进皮肤损伤愈合的修护功效的目的相似。同时，成纤维细胞是真皮层中疏松结缔组织的主要细胞成分，人源成纤维细胞模型的结果对体内作用有一定的参考性。故选用人源成纤维细胞进行细胞迁移试验，可以评价化妆品的修护功效。

5试剂和材料

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5.1细胞：人源成纤维细胞（扩增至P7代进行试验）

5.2磷酸盐缓冲溶液（PBS）：GIBCO；

5.3胰酶（0.25%）：GIBCO；

5.4新生牛血清（NBS）：浙江天杭生物科技有限公司；

5.5细胞培养液（DMEM，低糖）：GIBCO；

5.6噻唑蓝（MTT）溶液：取噻唑蓝粉末（阿拉丁，CAS：298-93-1，分析纯）配制成1mg/ml的储备液，过滤除菌，避光保存；

5.7细胞培养瓶：Corning；

5.8血清移液管：Falcon；

5.9离心管：Corning；

5.10细胞培养板：Corning；

6仪器

6.1倒置显微镜：具有拍摄功能；

6.2二氧化碳培养箱；

6.3电子天平：分度值为0.1mg；

6.4水平低速离心机；

6.5移液器：量程包含100-1000μl、20-200μl、2-20μl；

6.6生物安全柜；

6.7酶标仪；

6.8微孔板振荡器；

6.9计算机：能够运行ImageJ软件。

7试验步骤

7.1预试验（细胞毒性试验）

7.1.1铺板

预试验选用MTT法进行。选用生长良好的P7代的人源成纤维细胞，消化后稀释到合适的浓度，加入96孔板中。边缘孔使用无菌PBS填充，减少蒸发。放入培养箱中孵育24h左右。

7.1.2加样

孵育结束后，检查细胞贴壁情况，铺板率达到70-80%后即可加入受试物。受试物应当天配制，使用无血清培养液溶解，按照合适的倍数进行逐级稀释，一般设置7个或以上的浓度组。无法直接溶于水的样品，可用DMSO稀释后进行配制。设置空白对照组，仅加入无血清培养基。对照组与样品组每个浓度设置6个复孔。吸出培养液，加入样品后，放入培养箱内孵育24h左右。

7.1.3测定

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在孵育约20h、测定前4h在培养板中加入MTT溶液至终浓度为0.25mg/ml左右，继续孵育4h后，吸除上清，每孔加入150μlDMSO，低速振摇10分钟，于酶标仪570nm处测定吸光度。

7.1.4计算

获得吸光度数据后，计算样品组与空白对照组的吸光度之比，得到对应的细胞存活率。

细胞存活率%=空度×100

7.2正式试验（细胞迁移能力试验）

7.2.1浓度选择

预试验后获得细胞存活率数据，应与样品浓度应具有近似的线性关系。正式试验时，应根据样品剂量-细胞存活率梯度选择2-3个浓度，按照以下原则进行：

a）最高无明显毒性剂量（细胞存活率达到90%左右时的最高剂量）；

b）最低无毒性剂量（细胞存活率达到100%或更高时的最低剂量）；

所有的样品的最高浓度为其在无血清培养基中的最大溶解度。在获得正式试验阳性结果之前，可以适当调整浓度选择。

7.2.2铺板

准备6孔或24孔细胞培养板，在背面用记号笔横向划直线进行标记。选用生长良好的P7代的人源成纤维细胞，消化后稀释到合适的浓度，加入孔板中，放入培养箱中孵育24h左右。

7.2.2加样