犬细小病毒和犬冠状病毒双重RT-PCR检测方法征求意见稿.docx

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犬细小病毒和犬冠状病毒双重RT-PCR检测方法

1范围

本文件规定犬细小病毒病和犬冠状病毒的双重RT-PCR的检测方法、试剂、设备和操作步骤。

本文件适用于犬、猫等犬细小病毒和犬、貉、狐狸等犬科动物等犬冠状病毒的检测，也适用于其他易感动物的犬细小病毒和犬冠状病毒核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489

实验室生物安全通用要求

NY/T541

兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CPV：犬细小病毒（CanineParvovirus）CCV：犬冠状病毒（CanineCoronavirus）

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）RNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

DEPC:焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）

5试剂和耗材

5.1病毒RNA提取试剂

可使用Trizol试剂手工提取病毒RNA，也可选取商品化的病毒RNA提取试剂盒或自动核酸提取设备并参照说明书进行RNA提取。

5.2灭菌DEPC水

向1L超纯水中加1mlDEPC（使终浓度为1‰），静置4h以上，121℃高压30min，冷却以后，在超净台内及时打开瓶盖，过夜挥发，备用。

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5.3其他试剂

试验所需的其他试剂的配制见附录A。

5.4引物和探针

5.4.1采用针对CPV和CCV的引物

扩增CPV引物P1和P2，可扩增片段337bp，扩增CCV引物C1和C2，可扩增片段852bp。具体序列见附录B。

5.4.2采用其他引物

使用国家农业行政主管部门或海关总署批准的其他引物和探针，应对检测程序和判定标准做相应调整。

5.5阳性对照和阴性对照

含CPV和CCV的犬肾传代细胞（MDCK）细胞毒、CPV和CCV的疫苗株、CPV和CCV的DNA片段的重组质粒或其他商业化的CPV和CCV的阳性质控品均可作为阳性对照。正常未接毒的犬肾传代细胞或正常犬组织或细胞可作为阴性对照。

6仪器与耗材

6.1生物安全柜。

6.2梯度PCR仪。

6.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。

6.4组织研磨器或组织匀浆机。

6.5漩涡震荡器。

6.6冰箱，2℃~8℃和﹣20℃。

6.7超低温冰箱：可控温至-70℃。

6.8微量移液器：0.2μL~2μL，1μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL，并配备与移液器匹配的吸头。

6.9高压灭菌锅。

7操作步骤

7.1样品采集及运输

样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集易感动物组织、细胞培养物或粪便等样本用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处置。

7.2病毒RNA的提取

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7.2.1病毒核酸抽提使用Trizol手工提取，也可以使用等效的商品化病毒核酸提取试剂盒提取，在核酸提取区操作。

7.2.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数、阳性对照数和阴性对照数之和，对每个离心管进行编号。

7.2.3每管加入800μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL，颠倒10次混匀，4℃或室温10000r/min离心10min。

7.2.4取900μL上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加入500μL无水乙醇，混匀，室温放置3min；4℃或室温10000r/min离心5min。

7.2.5弃上清，沿管壁缓缓加入0.8mL~1mL75%乙醇，颠倒3~6次混匀，4℃10000r/min离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。

7.2.6用30μLDEPC水溶解沉淀，核酸在4℃冰箱可保存1~2天，-20℃冰箱