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鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验

一、试验原理

鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验是检测鸡新城疫病毒（NDV）感染的重要方法。该试验基于病毒对鸡红细胞表面的血凝素（HA）蛋白的亲和力，以及抗体对血凝素蛋白的特异性结合能力。在HA试验中，NDV能够使鸡红细胞发生凝集，其凝集能力与病毒颗粒的数量成正比。例如，在实验室条件下，使用0.5%的鸡红细胞悬液，当病毒浓度达到一定水平时，红细胞将出现明显的凝集现象。这一现象的原理是NDV血凝素蛋白能够与红细胞表面的受体结合，导致红细胞膜发生构象变化，从而引起凝集。

血凝抑制试验（HI）则是在HA试验的基础上，利用特异性抗体与病毒血凝素蛋白结合，从而抑制病毒对红细胞的凝集作用。在HI试验中，通常使用高稀释度的抗体来检测病毒。例如，在进行HI试验时，如果将抗体稀释至1:40，仍然能够抑制病毒引起的凝集，则表明该抗体对NDV具有较高的中和活性。这一试验方法不仅能够检测NDV的存在，还能够评估抗体对病毒的免疫保护效果。

在NDV的流行病学调查和免疫监测中，HA及HI试验具有重要的应用价值。例如，在2018年的一次NDV疫情中，研究人员通过HA试验检测了疑似感染鸡群的血液样本，发现病毒浓度为1:80，表明鸡群中NDV的感染率较高。随后，通过HI试验进一步验证了抗体的中和活性，发现抗体滴度在1:160以上，提示鸡群对NDV具有一定的免疫力。这一案例表明，HA及HI试验在NDV防控和免疫策略制定中具有重要作用。

二、试验材料

(1)试验材料主要包括病毒株、鸡红细胞、生理盐水、无菌试管、微量移液器、离心机、恒温水浴箱、显微镜、血凝素（HA）和血凝抑制抗体（HI）、抗体稀释液、阳性对照、阴性对照、空白对照以及相关的试剂和缓冲液。病毒株通常选用具有典型NDV特征的毒株，用于制备病毒悬液。鸡红细胞需选用新鲜、无污染的健康鸡红细胞，通常使用0.5%的鸡红细胞悬液。生理盐水用于制备病毒悬液和稀释抗体，保持试验环境的无菌状态。

(2)无菌试管和微量移液器是进行试验操作的关键工具，用于准确移取病毒悬液、抗体、红细胞等试剂。离心机用于分离病毒悬液中的杂质，提高病毒悬液的纯度。恒温水浴箱用于维持试验过程中的温度稳定，确保试验结果准确可靠。显微镜用于观察红细胞凝集现象，观察病毒与抗体的结合情况。HA和HI试剂是试验的核心，需要按照说明书进行配置和使用。抗体稀释液用于将抗体稀释至不同浓度，以便进行HI试验。阳性对照、阴性对照和空白对照分别用于验证试验结果的准确性、排除非特异性反应以及确定试验环境的污染情况。

(3)相关试剂和缓冲液包括磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等，用于制备病毒悬液、抗体稀释液、红细胞悬液等。这些试剂和缓冲液需要符合实验室要求，保证试验结果的准确性和可靠性。在试验过程中，还需注意试剂和缓冲液的储存条件，避免因储存不当导致试剂失效。此外，实验室应定期对试剂和缓冲液进行质量检测，确保其质量符合试验要求。

三、试验方法

(1)HA试验的步骤如下：首先，将病毒悬液按照1:10的比例用生理盐水稀释，制备成病毒悬液。然后，取无菌试管一支，加入100μl的病毒悬液，再加入100μl的0.5%鸡红细胞悬液，充分混匀后，置于37℃恒温水浴箱中30分钟。每隔5分钟轻轻摇动试管，观察红细胞凝集情况。若红细胞完全凝集，表明病毒具有血凝活性；若红细胞不凝集或部分凝集，则表明病毒血凝活性较弱或不存在。

(2)HI试验的步骤如下：首先，将抗体按照1:10的比例用生理盐水稀释，制备成抗体稀释液。然后，取无菌试管一支，加入100μl的病毒悬液，再加入100μl的抗体稀释液，充分混匀后，置于37℃恒温水浴箱中30分钟。每隔5分钟轻轻摇动试管，观察红细胞凝集情况。随后，将红细胞悬液加入试管中，继续置于37℃恒温水浴箱中30分钟。若红细胞完全凝集，表明抗体具有中和活性；若红细胞不凝集或部分凝集，则表明抗体中和活性较弱或不存在。根据抗体滴度判定NDV的免疫保护效果。

(3)试验结束后，需对结果进行记录和分析。在HA试验中，根据红细胞凝集程度，计算病毒的血凝效价。在HI试验中，根据抗体滴度，判断NDV的免疫保护效果。此外，还需进行空白对照、阳性对照和阴性对照，以排除非特异性反应和确定试验环境的污染情况。若试验结果与预期不符，需查找原因并重新进行试验。试验过程中，注意保持实验操作的规范性和一致性，以确保试验结果的准确性和可靠性。

四、结果分析与判定

(1)在HA试验中，结果分析主要关注红细胞的凝集程度。根据红细胞凝集的强度，可以判定病毒的血凝效价。如果红细胞完全凝集，通常表示病毒的血凝效价较高；如果红细胞仅有轻微凝集或完全不凝集，则可能表示病毒血凝活性较弱。对于血凝效价的判定，一般