2025年手把手教你荧光定量PCR（一）.pdfVIP

百学须先立志。——朱熹

手把手教你荧光定量PCR（一）

之前医学方小编教过大家如何在线利用NCBIprimerblast设计荧

光定量PCR引物，那么当我们有了引物，如何利用荧光定量PCR实验

来检测mRNA水平呢？今天小编先教给大家Real—timePCR最重要

的第一步，如何抽提高质量的RNA?

首先简单介绍一下实验中所用化学试剂耗材清单和作用，做到实

验时心中有数。

实验材料

Trizol

氯仿

异丙醇

无水乙醇

DEPC水(焦磷酸二乙酯)

Randomprimer

逆转录酶(AMV)及其buffer

RNaseinhibitor

新的没有用过的枪头

384孔板（透明）

DVD光盘（刻录拷贝数据）

八连PCR管

SYBRMasterMix

吾日三省乎吾身。为人谋而不忠乎?与朋友交而不信乎?传不习乎?——《论语》

实验试剂作用

01

Trizol主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，则其主要作用是裂解细胞、

抑制RNAse活性和蛋白质变性

2

氯仿作用（1）变性蛋白，（2）抽取苯酚，促进水相和有机相分

离；（3）去除脂溶性物质如油脂。配合的异戊醇的作用是消泡。

三层：上清RNA苯酚氯仿DNA下层蛋白质

3

异丙醇作用：破坏核酸的氢键而促进其从水相中沉淀，配合使用

的醋酸铵等盐则中和核酸负电荷，加速核酸聚积沉淀。

4

75%乙醇的作用是去除异丙醇和其它盐分。

5

DEPC水(焦磷酸二乙酯)是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而

抑制酶的活性。

RNA抽提步骤

在所有RNA实验中，最关键的因素是得到全长的RNA。实验失

人人好公，则天下太平；人人营私，则天下大乱。——刘鹗

败的主要原因是RNA酶的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，

如煮沸、高压灭菌等。RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。

因此操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

低温下操作

第一步：抽提RNA

1

最大起始量107个细胞，六孔板每孔加入Trizol1ml，充分混匀

裂解细胞，吹打至无粘稠(室温静置15min充分裂解)。

2

混匀，加入267ul氯仿（按照氯仿与Trizol体积比

200ul/0.75ml），充分震荡混匀，冰上3min。

3

12000g，15min，4℃。