课时4　突破基因工程类大题 学案（含答案）.docVIP

课时4突破基因工程类大题

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RT－RCR、实时荧光定量、PCR与反向PCR

①2022·全国乙卷，38；②2022·江苏卷，24；

①2020·江苏卷，33；②2020·山东卷，25

PCR定点诱变技术

①2023·辽宁卷，25；①2021·天津卷，16

单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测

①2024·黑吉辽卷，17、25；②2024·全国甲卷，38；③2024·河北卷，24；④2024·湖南卷，15；⑤2024·江西卷，12；⑥2024·浙江6月选考，19、20；

①2023·山东卷，25；①2022·福建卷，13

突破1基因工程的热考题型

题型一限制酶的选择技巧

(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点选择限制酶

①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点，如图乙)

(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)

[例1](2024·巴蜀中学适应考)科学家从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，进行克隆，复制了2400年前的DNA。某生物兴趣小组同学模拟了其中部分研究过程，设计了如下实验(MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ为4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG)。请回答以下问题：

(1)从解旋过程进行分析，PCR扩增木乃伊基因与体内DNA复制过程不相同的地方是___________________________________________________________

_____________________________________________________(答出两点)。

(2)若将图乙中质粒和图甲中木乃伊基因通过同种限制酶处理后，构建重组质粒，应选用的限制酶是________，选择理由是__________________________

________________________________________________________________。

(3)经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能正确表达，最可能的原因是_____________________________________________________

______________________________________________________________。

(4)据图丙分析，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A、B还应分别含有________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________菌落中的细菌。

题型二PCR中引物的设计与选择

利用PCR扩增目的基因(如干扰素基因)时，设计引物序列的主要依据是有一段已知目的基因(干扰素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。

(1)引物的作用：TaqDNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，TaqDNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。

(2)设计引物应遵循的主要原则

①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合。

②引物与靶序列间的Tm(指当50%的引物和靶序列表现为双链DNA分子时的温度)不应过低。

③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列。

④2个引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列。

⑤引物中碱基的分布应尽可能均匀，G＋C含量接近50%。

(3)引物的处理

由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。

(4)PCR循环时与引物相关的计算

PCR经过n次循环产生的DNA数为2n，一共有2n＋1条链，其中有2条链是DNA母链，不含引物，其他的每1条链均含1个引物，并且2种引物的数量相等，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2n＋1－2，需要某一种引物的总个数是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一个DNA由1条母链和第1种引物延伸的子链组成，另一个DNA由另1条母链和第2种引物延伸的子链组成，其他的DNA均由2种引物