环介导等温扩增技术原理.pptVIP

*PrincipleofLoop-mediatedisothermalamplification烟雨莫问环介导等温扩增技术原理环介导的等温扩增技术原理等温扩增技术简介环介导的等温扩增演示等温扩增技术的应用前景环介导的等温扩增检测几种等温扩增技术比较主要内容等温扩增技术(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。等温扩增的概念特异性高分析速度快成本低突变率低不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作检测核酸成分比检测微生物本身危险性小方便诊断等温扩增的优势应用环介导核酸等温扩增技术（LAMP）01滚环扩增技术RCA02单引物等温扩增SPIA03依赖解旋酶的等温扩增技术HAD04链替代扩增SDA05交叉引物扩增技术CPA06核酸依赖性扩增检测技术NASBA07Qβ复制酶反应08等温扩增的种类各类等温扩增技术的比较温度℃引物模板其他NASBA42需要2条RNA反转录酶，RNA酶H，T7RNA聚合酶SPIA421条RNA反转录酶，T7RNA聚合酶HDA37/65需要2条DNA解旋酶，扩增片段小SDA37/65不需要DNALAMP634条DNADNA聚合酶RCA37-65需要DNAQβ37不需要RNALAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。操作简单：只需一个水浴锅快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成?的时间损失特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。?高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300?bp以内。500?bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。环介导等温扩增核酸技术优势环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。12环介导等温扩增核酸技术壹60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物合成的DNA链取代模板互补链。肆LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度循环。?叁需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物贰扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶环介导等温扩增原理BstDNA聚合酶大片段是BacillusstearothermophilusDNA聚合酶的一部分，具有5→3DNA聚合酶活性

Bacillusstearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有内引物被使用。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。BIP引物：下游内部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。123456环介导等温扩增引物设计环介导等温扩增引物设计LAMP反应引物与对应模板区域环介导的等温扩增技术原理内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在BstDNA聚合酶作用下，从F2的3’末