《基于60Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程》DB23T 3897—2024.docxVIP

ICS65.020.01

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CCSB05

黑 龙 江 省 地 方 标 准

DB23/T3897—2024

基于60Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程

2024-12-30发布 2024-12-30实施

黑龙江省市场监督管理局??发 布

DB23/T3897—2024

前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由黑龙江省农业农村厅提出。

本文件起草单位：东北农业大学、黑龙江省绿色食品科学研究院、哈尔滨学院、黑龙江省农业科学

院。

本文件主要起草人：胡小梅、李凤兰、董士嘉、李孝忠、王浩、谷春涛、高爱丽、孙以新、冯旭、高云飞、虞琦、贺付蒙、田苗。

I

DB23/T3897—2024

基于60Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程

1 范围

本标准界定了基于60Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术的术语和定义，规定了秸秆降解真菌创制、突变菌株筛选鉴定、秸秆降解菌株保藏和档案管理。

本文件适用于60Coγ辐射诱变创制秸秆降解真菌种质资源的筛选与鉴定。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB10252 γ辐照装置的辐射防护与安全规范

GB/T17568 γ辐照装置设计建造和使用规范

GB/T23874 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法

HJ710.11-2014 生物多样性观测技术导则大型真菌

NY/T3494 农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定

SN/T2632 微生物菌种常规保藏技术规程

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

秸秆降解真菌

能够将作物秸秆分解、腐化的一类产孢丝状真菌。

4 秸秆降解真菌创制

4.1 菌种来源

从自然环境中分离的具有降解秸秆能力的真菌，置于-80℃冰箱冻存备用。

4.2 培养方法

4.2.1 培养基

4.2.1.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养基

马铃薯浸出粉12g，葡萄糖20g，琼脂15g，去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。4.2.1.2高粱粒培养基

高粱粒5g，去离子水5mL，121℃灭菌20min。

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4.2.1.3 产酶培养基（MA）

十二水磷酸氢二钠17.907g，硫酸铵1.4g，磷酸二氢钾2.0g，七水硫酸镁0.60g，氯化钙0.60g，尿素0.3g，失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.5mL，蛋白胨2.0g，微量元素溶液1mL，pH5.5，去离子水定容至1000mL。

4.2.1.4 微量元素溶液

七水硫酸亚铁0.5g，一水硫酸锰0.16g，七水硫酸锌0.14g，六水合二氯化钴0.2g，去离子水定容至100mL，0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

4.2.2 菌种活化

将冻存的菌种解冻后在PDA培养基上采用四区划线方法进行活化，长出单菌落后，备用。

4.2.3 孢子悬浮液制备

将菌种活化后长出的单菌落接种至高粱粒培养基中，30℃培养，菌丝长满平板48h后，将产生的孢子用无菌0.9%（w/v）生理盐水洗脱并用四层无菌纱布过滤除去菌丝体，在6000rpm条件下离心20min收集沉淀。将沉淀再用适量生理盐水重悬后，利用血球计数板计算孢子浓度，并用生理盐水将孢子浓度稀释至1×106CFU/mL～1×108CFU/mL。

4.3 辐射处理

4.3.1 辐射剂量

选择金属元素钴源（60Co）的γ射线进行辐射诱变处理，真菌孢子悬浮液的60Coγ辐射剂量以2000Gy为宜。

4.3.2 辐射装置

60Coγ辐射装置应符合GB/T17568的规定。

4.3.3 辐射方法

辐射方法应符合GB10252的规定。

5 突变菌株筛选鉴定

5.1 菌株筛选

5.1.1 筛选指标

筛选指标包括菌株致死率、形态指标、纤维素酶和半纤维素酶活力、木质素酶活力、和秸秆降解率。

5.1.2 致死率

··················································(1)

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式中：

LR—致死率；

Cc—阴性对照PDA平板菌落数；

CT—试验组PDA平板菌落数。

5.1.3 形态指标筛选

将辐射诱变后符合致死率≥85%的菌株孢子悬浮液稀释100倍