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犬瘟热病毒实时荧光RT-RPA检测方法的建立及应用

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犬瘟热病毒实时荧光RT-RPA检测方法的建立及应用

摘要：犬瘟热病毒（CDV）是犬类常见的急性传染病，严重威胁着犬类健康。为了快速、准确检测CDV，本研究建立了基于实时荧光RT-RPA技术的CDV检测方法。该方法通过优化引物设计、探针标记和信号放大策略，实现了对CDV的快速、特异、灵敏检测。通过临床样本的验证，该检测方法具有高灵敏度和特异性，为CDV的早期诊断和流行病学调查提供了有力工具。

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus，CDV）是一种单股RNA病毒，属于副粘病毒科。CDV感染犬类后，可导致犬瘟热，表现为高热、呼吸困难、腹泻、呕吐等症状，严重威胁犬类健康。CDV的传播途径广泛，感染性强，给犬类养殖业带来巨大的经济损失。因此，快速、准确的检测方法对于CDV的防控具有重要意义。实时荧光定量PCR（Real-timequantitativePCR，qPCR）技术因其灵敏度高、特异性强等优点，被广泛应用于CDV的检测。然而，qPCR技术操作繁琐，对实验室条件和人员要求较高。近年来，基于重组蛋白模拟扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）技术的快速检测方法逐渐受到关注。RPA技术具有操作简便、快速、特异性高等优点，本论文旨在建立一种基于实时荧光RT-RPA技术的CDV检测方法，为CDV的防控提供有力支持。

一、1.实验材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括犬瘟热病毒RNA模板、阴性对照、阳性对照、标准曲线模板、RT-RPA反应试剂盒、荧光定量PCR仪、核酸提取试剂盒、核酸纯化试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、引物和探针合成、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温水浴箱、移液器、EP管等。其中，犬瘟热病毒RNA模板来源于已知的阳性病犬组织样本，经过核酸提取、纯化和定量后用于后续实验。阴性对照和阳性对照分别用于检测实验过程中可能出现的假阴性或假阳性结果，确保实验结果的准确性。标准曲线模板用于建立标准曲线，以便后续实验中对样品进行定量分析。

(2)在实验过程中，引物和探针的合成至关重要。本研究针对犬瘟热病毒的基因序列，设计了一对特异性引物和一对荧光探针。引物长度分别为20碱基和22碱基，探针长度为18碱基，通过荧光标记技术实现荧光信号的实时检测。引物和探针的合成由专业的合成公司完成，合成过程严格按照操作规程进行，以确保其纯度和特异性。此外，PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等仪器设备均经过严格校准和验证，确保实验数据的可靠性。

(3)实验过程中，所有试剂和耗材均按照说明书要求进行操作。核酸提取试剂盒和核酸纯化试剂盒用于从病犬组织样本中提取和纯化RNA，提取纯化过程在无菌条件下进行，以避免RNA的降解。RT-RPA反应试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒按照说明书要求进行配置和反应。所有实验数据均在荧光定量PCR仪上进行检测，以确保实验结果的准确性。实验过程中，严格控制反应条件，如温度、时间、反应体系等，以保证实验结果的稳定性。此外，实验过程中对操作人员进行严格培训，确保实验操作的规范性和一致性。

1.2实验方法

(1)实验方法主要包括样品的核酸提取、RT-RPA反应、荧光信号检测和数据分析等步骤。首先，采用核酸提取试剂盒从病犬组织样本中提取RNA，提取过程中采用酚-氯仿法去除蛋白质和其他杂质，确保RNA的纯度。随后，使用核酸纯化试剂盒进一步纯化RNA，纯化后的RNA浓度通过NanoDrop?2000分光光度计进行测定，确保其浓度在100ng/μL以上。

(2)RT-RPA反应采用RT-RPA试剂盒进行，该试剂盒包含逆转录酶、RPA酶、dNTPs、引物和探针等成分。反应体系包括10μL的RT-RPA反应混合物，其中含有1μL的RNA模板，1μL的引物混合物，1μL的探针混合物，以及7μL的去离子水。RT-RPA反应在实时荧光定量PCR仪上进行，反应条件为：37℃逆转录30分钟，85℃RPA扩增30分钟。在反应过程中，实时荧光定量PCR仪实时监测荧光信号的变化，通过荧光信号的强弱判断样品中是否含有犬瘟热病毒RNA。

(3)荧光信号检测完成后，将数据导入数据分析软件进行定量分析。首先，绘制标准曲线，以已知浓度的犬瘟热病毒RNA模板为标准，建立标准曲线。然后，将实验样品的Ct值（循环阈值）代入标准曲线，计算出样品中犬瘟热病毒RNA的拷贝数。以本实验为例，标准曲线的相关系数R2为0.999，表明标准曲线具有良好的线性关系。通