DB21T 2209-2013 海绵种属分子生物学鉴定技术规程.docxVIP

ICS65.150B51

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2209—2013

海绵种属分子生物学鉴定技术规程

TechnicalSpecificationofIdentifyingSpongethroughMolecularBiologyTechniques

2013-12-12发布2014-01-22实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2209—2013

前言

本标准是按照GB/T1.1—2009给出的规则起草的。本标准由大连海洋大学提出。

本标准由大连市质量技术监督局归口。

本标准主要起草单位：大连海洋大学、中国科学院大连化学物理研究所

本标准主要起草人：付晚涛、郑长波、曹旭鹏、苏延明、宋悦凡、潘勍宇、安宗福。本标准于2013年**月**日首次发布。

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DB21/T2209—2013

海绵种属分子生物学鉴定技术规程

1范围

本标准规定了海绵种属分子生物学鉴定的总则、海绵样品采集与保存、海绵种属鉴定方法。本标准适用于海绵的样品采集、保存、处理和种属分子生物学鉴定方法。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。2.1

海绵

海绵（Sponge）是最低等多细胞动物（Metazoan），在动物界中单独构成多孔动物门（PhylumPorifera）。2.2

海绵分子条码

海绵的细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（cytochromeoxidasesubunitⅠ,简称COI）的DNA序列为海绵的保守基因序列信息，作为海绵分子条码。

3总则

3.1原理

海绵细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COI）的DNA序列为海绵的保守基因序列，作为海绵分子条码，用于鉴定海绵种属。通过分子生物学技术——聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）扩增海绵的COI基因部分序列，测序后与已经鉴定海绵的COI基因序列比对，以此鉴定海绵的种属。

3.2仪器与设备

——野外生物样品保存箱或泡沫保温箱；——高速低温冷冻离心机；

——普通PCR仪；——水浴锅；

——-80℃冰柜。

3.3试剂与材料

——无水乙醇（分析纯）；——液氮；

——细胞裂解缓冲液（10mmol/LTris-Cl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；0.1%(m/V)SDS）；——异丙醇（分析纯）；

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——醋酸甲溶液（60ml5mol/L醋酸钾；11.5ml冰醋酸；28.5ml超纯水）；——细胞裂解液（20mmol/LTris-Cl，pH7.6）；

——蛋白酶K（20mg/ml）；

——TE缓冲液（pH7.6）（100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0）；——超纯水；

——PCR酶(5U/μL)；

——10×PCR缓冲液（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2，在1.05kg/cm2高压灭菌10min）。

4海绵样品采集与保存

4.1对于潮间带海绵，在海水退潮后，先拍照或摄像，再用金属或木质的小板采集海绵样品于塑料采样瓶中，立刻加入75%乙醇浸没海绵样品并超过2cm以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外生物样品保存箱，用于分子生物学鉴定。

4.2对于潮下带海绵和深海海绵，采样器采集海绵后放入塑料采样瓶中并在瓶中装满样品附近的海水。装有海绵样品和海水的样品瓶被带上船或带上岸后，倒掉采样瓶中海水，立刻加入75%乙醇浸没海绵样品并超过2cm以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外样品保存箱，用于分子生物学鉴定。

4.3上述样品均可在4℃条件下保存1天。

4.4海绵样品采集与保存记录于《海绵资源调查采样表》（详见附录A）。

5海绵种属鉴定方法

以海绵的COI基因序列为鉴定海绵种属的分子生物学信息。

5.1海绵DNA提取与纯化

5.1.1取约0.5g保存在乙醇中的海绵样品，放入事先用液氮冷却过的研钵中，加入液氮研磨海绵样品成粉末状。

5.1.2将研磨成粉末的海绵样品移入装有600μL细胞裂解缓冲液的聚丙烯离心管中混匀，加入3μL蛋白酶K，在55℃水浴锅上放置3h以上。

5.1.3从水浴锅取下装有海绵的离心管，放置室温后，加入200μL醋酸钾溶液