DB21T 2631-2016 真鲷虹彩病毒LAMP 检测方法.docxVIP

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DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2631—2016

真鲷虹彩病毒LAMP检测方法

Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforRedseabreamiridoviralvirus

2016-05-09发布2016-07-09实施

辽宁省质量技术监督局发布

I

DB21/T2631—2016

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。

本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：肇慧君，胡强，刘钊，张达古拉，栾慎顺，张雪。

1

DB21/T2631—2016

真鲷虹彩病毒LAMP检测方法

1范围

本标准规定了真鲷虹彩病毒(Redseabreamiridoviralvirus，RSIV）的环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测方法。

本标准适用于RSIV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样

SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范

3符号代号和缩略语

下列缩略语适用于本文件。

LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）Betaine：甜菜碱

Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)]dNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）

4试剂、仪器和耗材

4.1试剂

4.1.1引物

选取特异性的RSIVDPO基因序列，设计出能专一性鉴别真鲷虹彩病毒的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：

外引物1（F3）：5′-AGATGCACTGCTCAAACTCG-3′外引物2（B3）：5′-CTGATTGAGAAAGCCGCTCA-3′

内引物1（FIP）：5′-CCGCGCATCACTCGATGAACTGCGCTCAAAGAAGGCCGAC-3′内引物2（BIP）：5′-CGTGGCCCAGCTGTATGTAGC-TCTCCTCAAGACGGTGGTG-3′

4.1.2商品化DNALAMP法扩增试剂盒。

其中：BstDNApolymerase：8U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

2

DB21/T2631—2016

2×反应缓冲液（RM）：含40mMTris-HCL（pH8.8）、20mM氯化钾溶液、20mM硫酸铵溶液、16mM硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6Mbetaine（甜菜碱）、2.8mMdNTPs每种。

4.1.3荧光目视染料。

4.2仪器与耗材

4.2.1Loopamp浊度仪：日本荣研化学株式会，型号LA-320C。

4.2.2组织研磨器。

4.2.3普通冰箱和超低温冰箱。

4.2.4反应管：由朗报loopamp提供。

4.2.5移液器：量程0.5μL～10μL，量程10μL～100μL，量程100μL～1000μL。

4.2.6吸头，配套移液器待用。

5生物安全要求

采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T2123-2008的有关规定。

6操作步骤

6.1样本的采集与处理

6.1.1采样

按GB/T18088的标准采集样品。体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长大于4cm的鱼取脾和肾。

6.1.2样品处理

从病鱼的脾和肾组织采集的样品，按照重量体积1:10的比例，加入0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.2)，用组织研磨器制备组织匀浆，备用。

6.2RSIV的LAMP检测

6.2.1核酸提取

DNA核酸提取可使用市售商品化的DNA抽提试剂盒对组织匀浆液进行抽提。

6.2.2LAMP反应体系

LAMP扩增反应采用脱氧核糖核酸扩增试剂盒（LAM