《生物工程实验》课件.pptVIP

课程概述课程目标本课程旨在培养学生生物工程实验的基本技能，包括细胞培养、分子生物学、蛋白质工程等方面。学生将学习并掌握各种实验技术，并能够独立进行实验操作。课程内容

实验总则1遵守实验室安全规则，注意个人防护，实验过程中要规范操作，认真记录实验数据，并做好实验报告撰写。2实验前要认真预习实验内容，了解实验目的、原理、方法和步骤，并准备好所需的试剂、仪器和耗材。

安全注意事项实验前要了解所有试剂的毒性，佩戴防护眼镜、手套等防护用品，避免直接接触危险化学品。注意实验室的安全标识，避免使用明火，及时清理实验台，并保持实验室通风。实验过程中如有意外情况，要及时报告老师，并进行相应的处理。

实验设备及耗材细胞培养培养箱、显微镜、移液器、离心机、培养皿、培养瓶、吸管等。分子生物学PCR仪、电泳仪、紫外灯、离心机、试剂盒、微量离心管、移液器、凝胶等。蛋白质工程超声波破碎仪、离心机、层析柱、电泳仪、紫外灯、透析袋等。

细胞培养实验1准备准备培养基、血清、试剂、培养皿、培养瓶等。2接种将细胞接种到培养皿或培养瓶中，在培养箱中培养。3培养定期更换培养基，观察细胞生长情况，并进行相应的处理。4传代当细胞生长到一定密度时，进行传代培养，将细胞转移到新的培养皿或培养瓶中。

细胞计数及传代细胞计数使用血球计数板进行细胞计数，计算细胞浓度和活力。传代步骤1.用胰蛋白酶消化细胞，将细胞从培养皿或培养瓶中分离下来。步骤二2.离心收集细胞，用新鲜的培养基重悬细胞，并接种到新的培养皿或培养瓶中。步骤三3.将新的培养皿或培养瓶放入培养箱中继续培养。

细胞增殖分析MTTMTT法是一种常用的细胞增殖分析方法，通过测定细胞内线粒体的活性来反映细胞的增殖情况。1BrdUBrdU法是另一种常用的细胞增殖分析方法，通过测定细胞中BrdU的掺入量来反映细胞的增殖情况。2CCK-8CCK-8法是一种较新的细胞增殖分析方法，与MTT法类似，但操作更简单，灵敏度更高。3

细胞毒性评估MTTMTT法可用于评估药物或其他物质对细胞的毒性，通过测定细胞存活率来反映毒性大小。LDHLDH法是另一种常用的细胞毒性评估方法，通过测定细胞内LDH的释放量来反映细胞的损伤程度。细胞形态通过观察细胞形态的变化，如细胞形态的改变、细胞凋亡等，可以初步判断细胞的毒性。

细胞凋亡检测1流式细胞术通过检测细胞中凋亡相关蛋白或核酸的变化，可以判断细胞是否发生了凋亡。2AnnexinV/PIAnnexinV/PI双染色法是一种常用的细胞凋亡检测方法，可区分不同阶段的凋亡细胞。3TUNELTUNEL法是另一种常用的细胞凋亡检测方法，通过检测细胞内DNA断裂的程度来判断细胞凋亡程度。

细胞周期分析1流式细胞术通过检测细胞中DNA含量的变化，可以分析细胞周期各个阶段的分布。2PI染色PI染色是一种常用的细胞周期分析方法，可以区分不同阶段的细胞。3数据分析使用软件分析细胞周期各个阶段的比例，并根据结果进行进一步研究。

蛋白质提取与定量蛋白质提取是生物工程实验中重要的一个环节，通过不同的提取方法可以获取不同性质的蛋白质，提取后需要对蛋白质进行定量，以便后续实验的开展。

WesternBlot分析蛋白分离使用SDS电泳将蛋白质按分子量大小进行分离。蛋白转膜将分离后的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用封闭液封闭膜上的非特异性结合位点。抗体结合使用特异性抗体与膜上的目标蛋白结合，并用辣根过氧化物酶标记的二抗进行识别。

免疫荧光染色1细胞固定使用合适的固定液固定细胞，以便后续步骤中抗体可以与细胞结合。2抗体孵育使用特异性抗体与细胞内目标蛋白结合，并用荧光标记的二抗进行识别。3显微镜观察使用荧光显微镜观察细胞，并拍摄图像，分析目标蛋白的表达位置和强度。

基因转染实验1.质粒准备准备含有目标基因的质粒，并进行质量检测。2.细胞准备准备合适的细胞，并进行培养，使其处于最佳状态。3.转染使用合适的转染试剂将质粒转染到细胞中。4.筛选筛选成功转染的细胞，以便进行后续研究。

质粒构建与测序质粒构建使用酶切、连接等方法，将目标基因插入到质粒载体中，构建重组质粒。测序验证对构建的重组质粒进行测序，验证其序列是否正确，以及目标基因是否成功插入。

基因表达分析通过RT-PCR、qPCR等方法检测基因表达量，分析目标基因的表达情况。

PCR基础及实验1PCR原理PCR技术是体外扩增DNA片段的技术，利用DNA聚合酶的特性，以模板DNA为基础，进行循环反应，最终获得大量目标DNA片段。2实验步骤PCR实验主要包括模板DNA、引物、dNTP、Taq酶、缓冲液等组成，按照特定的温度条件进行循环反应。3应用PCR技术在分子生物学、遗传学、医学等领域有着广泛的应用，可用于基因克隆、基因诊断、亲子鉴定等。

常见PCR实验方案常规PCR用于扩增目标