T_CVMA 202-2024 副猪格拉菌抗体微量凝集试验操作规程.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准T/CVMA202—2024

副猪格拉菌抗体微量凝集试验操作规程

ProceduresfortheoperationofmicroagglutinationtestforantibodyagainstHaemophilusparasuis

2024-12-4发布2024-12-4实施

中国兽医协会发布

T/CVMA202—2024

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由青岛市动物疫病预防控制中心提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件主要起草单位：青岛市动物疫病预防控制中心、青岛农业大学、青岛博霖生物科技有限公司、青岛市黄岛区动物疫病预防与控制中心。

本文件主要起草人：李彦、赵永达、郭莉莉、段笑笑、杨胜男、邴啟政、马帅、尹斐斐、田丽华、高斌、厉博雅、王守杰、柳妍玲、陈佳文。

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副猪格拉菌抗体微量凝集试验操作规程

1范围

本文件规定了副猪格拉菌微量凝集抗体检测的操作规程。

本文件适用于副猪格拉菌的抗体水平检测、疫病诊断及监测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CFU：菌落形成单位（Colony-FormingUnits）HPS：副猪格拉菌（Haemophilusparasuis）

MAT：微量凝集抗体检测试验（micro-agglutinationtest）PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphatebelancedsolution）

SPF：无特定病原体动物（SpecificPathogenFree）

5试剂与材料

5.1阳性血清：由副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准菌株制备的疫苗免疫SPF兔后制备的高免血清。

5.2阴性血清：采集SPF兔血液制备的血清。

5.3菌株：副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准菌株，冻干型。

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6仪器设备

6.1紫外分光光度计：190~1100nm。

6.2恒温恒湿培养箱：0℃~65℃、±1.0℃;不均匀度≤±1℃。

6.3分析天平：精度为0.001g。

6.4离心机：转速不低于13,000r/min。

6.5冰箱：2℃~8℃和-20℃以下。

6.6酸度计。

6.7电热恒温水槽：室温至100℃,温度精度±0.5℃。

6.8涡旋振荡器。

6.9微量移液器（量程：0.5μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL和200μL~1000μL）。

6.10无菌离心管（规格：1.5mL、10mL、50mL）。

7实验步骤

7.1通则

应符合GB19489和NY/T541中关于实验室生物安全和兽医诊断样品的采集、保存与运输的要求。

7.2血液样品采集与处理

静脉无菌采血。采集后的血液室温静置不少于2h，待自然凝固后，4000r/min离心10min，吸出上层血清待检。

7.3样品保存和运输

样品采集后应冷链运输，并于24h内送达实验室。在2℃~8℃条件下保存不应超过24h，如超过24h需冷冻保存。如无法冷链运输，应将样品置于含10%甘油的平衡盐溶液（配制方法按照附录A中A.1）中运输。

7.4抗原制备

7.4.1菌株复苏取副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准冻干菌株，加入2.0mL灭菌生理盐水溶解，分别划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂TSA培养基（含5%无菌牛血清和0.01%NAD）（配制方法按照附录A中A.2），