T CVMA 216—2025 小反刍兽疫病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法.pdfVIP

ICS11.220

CCSB41

团体标准

T/CVMA216—2025

小反刍兽疫病毒双抗原夹心ELISA抗体

检测方法

DoubleantigensandwichtELISAfordetectionofpestedespetits

ruminantsvirusantibody

2025-2-14发布2025-2-14实施

中国兽医协会发布

小反刍兽疫病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法

1范围

本文件规定了小反刍兽疫病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法的技术原理、试剂与材料、仪器与设

备、操作步骤、试验成立条件和结果判定等内容。

本文件适用于检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin）

HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）

TMB：四甲基联苯胺（TetramethylBenzidine）

5技术原理

采用双抗原夹心法的技术与原理，通过待测样本与包被板上的小反刍兽疫抗原的特异性抗体反应，

形成抗原-抗体复合物，再加入酶结合物（酶标小反刍兽疫抗原），则形成免疫复合物，通过显色液显

色酶标仪读取OD值。通过待测样品（S）/阳性对照（P）的比值，计算待测样品中PPRV抗体，S/P值与

PPRV抗体含量成正相关。

6试剂与耗材

6.1小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白和pET-32a-(NH)蛋白制备，见附录A。

6.2酶结合物（HRP标记的小反刍兽疫病毒pET-32a-(NH)蛋白）。

6.3包被板的制备，见附录B。

6.4阴性对照和阳性对照的制备，见附录C。

6.5其他相关试剂的配制，见附录D。

7仪器与设备

7.1酶标仪，波长为450nm。

7.237℃恒温培养箱。

7.3冰箱，2℃~8℃和﹣20℃。

7.4单道微量移液器（0.5µL~10µL；10µL~100µL；20µL~200µL；100µL~1000µL）、多道移

液器（300µL）。

7.5酶联反应板、血清稀释板：96孔一次性U型血凝板或96孔细胞培养板。

7.6一次性注射器（5mL、10mL）。

8样品的采集及保存

8.1样品采集

按照NY/T541中规定进行样品的采集与处理。按常规方法抽取2mL~3mL血液置洁净干燥的试管

中，静置约60min，待血液凝固后4000r/min离心10min（也可将血液样品静置约120min，待血液凝固

自然析出血清），分离血清。血清清亮，无溶血、无污染。

8.2血清样品的保存与运输

按照NY/T541中规定进行血清样品的存放与运输。血清样品置2℃~8℃条件下保存。若超过一周

检测，置于-20℃以下冷冻保存。

9操作步骤

9.1样品准备

将待检样品从2℃~8℃或-20℃冰箱取出，静置至室温备用。

9.2加样

将待检样品用样品稀释液10倍稀释后备用。取出包被板，所有检测孔中加入90μL样品稀释液后，

分别在样品孔、对照孔中加入10μL样品、阴性对照、阳性对照，振荡混合均匀。

9.3温育