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胚胎干细胞介导法：将目的基因转移入ES，重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因ES进行克隆，可培育转基因个体。在小鼠上应用成熟，大动物较晚。从猪胚胎中获得了干细胞克隆系1988，牛的胚胎干细胞1990。建立大家畜ES细胞系仍很困难，但随着一些相关关键技术的成熟，ES细胞介导法将会在转基因动物的研究中起到更加重要的作用直接用精子作为外源DNA载体的基因转移方法。精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以进入精子头部，受精后能发育成转基因动物，其整合率低（鸡为6.0%），但表达率高达50%。许多因素影响DNA与精子结合。较长的DNA片段比较短的DNA片段（150～750dp）更容易被精子所摄取。对精子和附睾精子的清洗可提高精子与DNA的结合率。目前已采用阳离子脂质体介导法，脂质体借静电作用吸附于细胞表面，通过与细胞膜融合，细胞内吞而将结合的基因导入细胞。精子载体法Anthony等（1999）尝试一种新方法：预先将小鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白GFP报告分子的外源DNA短时间（1min）共孵育，然后徽注射入减数分裂II期的卵母细胞质中，取得64%～94%转基因表达胚胎。将转GFP的胚胎移植，20%的后代表现为基因整合。此项研究揭示，精子膜经冷冻干燥或解冻处理后，外源DNA可穿过外膜，吸附于内膜。因此外源DNA能通过精子的徽注射有效转入卵母细胞，经膜处理的携外源DNA精子的徽注射是一种有效的转基因手段。受精前卵细胞显微注射法四种方法比较方法显微注射胚胎干细胞逆转录病毒精子介导优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb外源DNA的整合率高；整合在生殖细胞中的比例也很高。可在整合点整合转移基因的单个拷贝；该方法简单、方便缺点精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA在动物各种组织中的分布不均有些结果不能重复01040203酵母人工染色体(YAC)载体是近年发展起来的新型载体,它能克隆百万对碱基的大片段DNA。作为制作转基因动物载体具有以下优点：保证大片段DNA的完整性提高较长外源片段在动物转基因时的整合率保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应.因此，YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景酵母人工染色体(YAC)法第二节动物生物反应器一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。※医药领域的应用 a.抗出血药物 b.抗凝血药物 c.血栓治疗药物 d.肺气肿治疗药物 e.免疫治疗药物f.人型化单克隆抗体荷兰：GenPharm公司用转基因牛生产EPO，产值40亿美元英国：生产?1-抗胰蛋白酶制剂（治疗肺气肿病）的转基因羊,一升羊奶6000美元1999年，只有三种产品进入临床实验；到2009年，已经有70多种进入临床实验或即将进入市场。应用转基因动物/乳腺生物反应器生产药用蛋白是药物生产的一种全新模式，具有投资成本低、药物开发周期短和经济效益高等优点，将成为21世纪最具有巨额经济利润的新型医药产业。通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白，是研究的热点。从1987年Gordon等在转基因小鼠乳汁中得到人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA），到现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达。01我国已构建了30多种乳腺特异表达载体，在表达载体构建的合理性和有效性方面取得了成效。在转基因小鼠的乳汁中，人血清白蛋白的表达量达到3.5g/L，人凝血因子IX的表达量已达到50mg/L以上，人EPO的表达量达到100mg/L以上，BLG的表达量达到25g/L，均属于国际领先水平。02动物乳腺生物反应器动物乳腺生物反应器应用重组DNA技术和转基因技术,先将外源基因置于乳腺特异性调控序列之下,再将该基因转移到尚处于原核阶段或1～2细胞的受精卵的动物胚胎中,经胚胎移植得到转基因乳腺表达的动物个体,通过回收乳汁获得表达产物。表达载体的构建制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白特异性在乳腺中的高效表达，外源基因在乳腺表达需要有一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列。传统表达载体都是选用某种乳蛋白基因的调控序列作为启