免疫组化染色技术培训.ppt

主要讲述的内容;免疫组织化学又称免疫细胞化学，其主要原理是用

荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细

胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定

量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧

光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的

物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可应用相应的特异性抗体，将其用免疫细胞化学手段检出，并研究。;1.高度的特异性

抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细

胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，

具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基

酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。;2.敏感性高

现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度

保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增

敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证

可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子

显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或

基因水平的检测技术。;3.方法步骤统一

若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。

4.形态、机能和代谢密切结合

是一种集定性、定位和定量密切结合；形态、

机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。;抗原修复;?化学方法(酶消化方法)

胰蛋白酶(trypsin)消化方法酶浓度一般为0.05%~0.1%,

胃蛋白酶(pepsin〉消化方法0.4%胃蛋白酶

链霉蛋白酶(poruse)消化方法浓度为0.1%。

;

?物理方法

单纯加热方法;

高压加热方法;

微波方法;微波方法;抗体的标记;免疫组化染色中比较成熟的标记物有：异硫氰酸荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白、胶体金、葡萄球菌A蛋白、生物素、放射形核素等。

由于标记物和抗体结合，酶促反应的定位就间接地显示抗原-抗体反应的定位。

;免疫组织化学染色中的非特异性着色;在滴加一抗前，采用非免疫动物血清封闭组织中的带电集团，避免与第一抗体的非特异性结合。

阻断内源性酶。如3%的H2O2等。

增加第一抗体的稀释度

调整孵育时间及反应???度

避免染色过程中标本干枯等方法。 ;免疫组化染色方法;免疫荧光法的基本原理;免疫酶组织化学方法;

标记抗体法

不标记抗体法;理想的标记酶的要求

酶的活性高且稳定

终产物稳定，不扩散，有良好的定位

酶和抗体的结合不影响抗原和抗体的结合

在组织中和体液中不存在内源性的酶及其底物;辣根过氧化物酶（HRP）

稳定性好，在PH3.5～12范围,60℃加热15分钟不失活

穿透性强，溶解度大.

底物为H2O2，DAB（3′，3-二氨基联苯胺）为供氢体,反应式为：

HRP.H2O2+DH2HRP+D+2H2O

碱性磷酸酶（AP）

;ABC三步法(亲和素-生物素-过氧化物酶连结法);ABC复合物;ABC复合物;优点：;步骤：;步骤;

?SP法或LSAB、SABC法(链亲和素-过氧化物酶连结法)

;

IGS法(免疫金法)：

用金标记代替酶标记。;免疫组化结果的判断原则;免疫组织化学的应用;(一)提高病理诊断的准确性;1、激素受体及生长因子的检测在预后及治疗方面的应用;如对乳腺癌与激素受体关系的研究已有了较明确的结论，即雌激素受体阳性的乳腺癌患者预后优于阴性者，而且阳性者对内分泌治疗反应好、无瘤生存期延长。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。;2、癌基因蛋白表达的临床及预后方面的研究应用;在乳腺癌的研究中发现表达cerbB-2的浸润性乳腺癌患者预后差。恶性度高者阳性率高。在卵巢癌中阳性率为30%，而且提示，阳性表达的卵巢癌者预后要差。;c-myc是作用于核内DNA的癌基因，可剌激DNA的合成。c-myc的过度表达则促进肿瘤的生长和发展，因而肿瘤的侵袭性增加。在对宫颈癌、小细胞肺癌的研究中已证实，c-myc表达增加者存活期缩短。;p21是一种ras癌基因蛋白，己发现在肝细胞癌、大肠癌中表达增高，在卵巢癌亦有过度表达的报道。对于其预后意义则仍有一些不同的看法。;3、对肿瘤细胞增生程度的评价;4、发现微小转移灶;5、在肿瘤分期上的意义;6、指导肿瘤的治疗;7、在肿瘤病理学的研究和诊断中的其他应用;(四)病原微生物的检查

;步骤：;步骤