《微观病毒世界》课件.ppt

*************************************病毒培养技术细胞培养细胞培养是病毒分离和繁殖的最常用方法。根据病毒特性选择适合的细胞系，如Vero细胞（源自非洲绿猴肾脏）常用于培养多种病毒，HeLa细胞（源自人宫颈癌）适合培养脊髓灰质炎病毒，MDCK细胞（源自犬肾）适合培养流感病毒。培养方法包括：单层细胞培养：细胞贴壁生长，适合多数病毒悬浮细胞培养：细胞悬浮在培养液中，便于大规模生产器官培养：保持组织结构，更接近体内环境鸡胚培养受精鸡蛋提供近似体内的多组织环境，是培养某些病毒的良好系统。根据病毒特性，可选择不同接种部位：尿囊腔接种：适合流感病毒等呼吸道病毒羊膜腔接种：适合麻疹病毒、腮腺炎病毒等卵黄囊接种：适合某些立克次体和病毒漿尿膜接种：适合痘病毒，可观察特征性斑块鸡胚培养虽然传统但仍广泛应用于流感疫苗生产。病毒培养是研究病毒生物学特性和制备疫苗的基础。培养过程中，通常通过观察细胞病变效应（CPE）初步判断病毒生长。不同病毒产生的CPE各有特点，如肠道病毒引起细胞圆缩和脱落，疱疹病毒形成多核合胞体，腺病毒使细胞呈葡萄串样变化。随着分子生物学技术发展，也可通过检测病毒核酸或抗原评估病毒复制。病毒分离和纯化初步处理病毒培养物首先经过低速离心（1,000-3,000g）去除细胞碎片和大颗粒杂质。随后通过过滤进一步清除残留杂质，常用孔径0.22-0.45μm的滤膜，确保病毒通过但细菌被阻留。某些方法如PEG沉淀、硫酸铵沉淀可作为初步浓缩手段。超速离心利用病毒颗粒较大的沉降系数，通过高速离心（20,000-30,000g）使病毒沉淀。这一步可以大幅富集病毒粒子，是病毒纯化的关键步骤。离心条件（转速、时间、缓冲液组成）需根据特定病毒特性调整，以获得最佳分离效果。密度梯度离心为获得高纯度病毒制剂，将初步纯化的病毒样品加载到密度梯度上进行进一步分离。常用CsCl或蔗糖建立连续或阶梯密度梯度。病毒在梯度中形成可见条带，根据病毒的浮力密度分布在特定位置，可精确收集目标条带。纯度鉴定通过多种方法评估病毒纯度，包括电子显微镜直接观察形态均一性，SDS分析蛋白组成，紫外吸收比值（A260/A280）判断核酸与蛋白质比例，以及PCR检测特异性病毒序列。高纯度制剂对后续结构分析、免疫学研究至关重要。电子显微镜技术透射电子显微镜(TEM)透射电子显微镜是观察病毒形态结构的最重要工具，分辨率可达0.1nm，远超光学显微镜。TEM利用电子束穿过超薄样品，成像原理类似于光学投影：样品制备：负染色（使用磷钨酸、醋酸铀等重金属染色剂）或超薄切片成像过程：电子束透过样品被散射，形成明暗对比应用优势：可清晰观察病毒颗粒的整体形态、大小和内部结构主要限制：样品需在真空环境下观察，不能观察活体样本扫描电子显微镜(SEM)扫描电子显微镜主要用于观察样品表面形态，分辨率约1-10nm。SEM利用电子束扫描样品表面，收集反射电子或二次电子成像：样品制备：干燥后喷金属涂层增强导电性成像过程：电子束逐点扫描样品表面，收集反射信号应用优势：提供三维立体感强的表面形态图像病毒学应用：观察病毒感染细胞表面变化、病毒出芽过程近年来，冷冻电子显微镜技术(Cryo-EM)在病毒学研究中取得重大突破。该技术将样品快速冷冻在接近原生状态，无需染色或固定，可观察病毒天然构象。结合单颗粒分析和三维重建，冷冻电镜可解析病毒结构至近原子水平（2-3?分辨率）。这一技术为理解病毒-受体相互作用、抗体中和机制提供了关键信息，已成功应用于解析SARS-CoV-2刺突蛋白结构，为疫苗和药物设计提供了关键依据。分子生物学技术1核酸提取从临床样本或培养物中分离病毒核酸是后续分子检测的基础。常用方法包括：酚-氯仿提取法、硅胶柱提取法和磁珠法。自动化核酸提取系统大大提高了效率和标准化水平，减少了操作人员感染风险。提取质量直接影响下游检测的灵敏度和特异性。PCR技术聚合酶链式反应是病毒检测的核心技术。常用变体包括：RT-PCR（针对RNA病毒）、实时荧光定量PCR（提供定量结果）、巢式PCR（提高灵敏度）和多重PCR（同时检测多种病原体）。PCR技术的出现彻底变革了病毒诊断领域，使检测时间从传统培养的数天缩短至数小时，且具有极高的特异性和灵敏度。基因测序DNA测序技术是研究病毒基因组结构和进化的关键工具。从传统的Sanger测序到新一代测序技术（NGS），病毒基因组分析的深度和广度得到了极大拓展。全基因组测序可提供病毒变异、重组和进化的全貌，对流行病学调查和疫苗设计至关重要。第三代测序技术（如纳米孔测序）的便携性使现场快速测序成为可能。分子