柱层析分离色素.docx

柱层析分别色素

试验目的

1(进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。

2(学会用柱层析法分别色素的操作技术，了解层析分析的有关学问。试验原理

叶绿体色素是植物吸取太阳光能进展光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分别叶绿体色素是对其生疏和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。

分别色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是依据混合物中各组分对固定相的吸附力量，以及对洗脱剂(即移动相)的溶解度不同将各组分分别。常用的柱色谱有吸附色柱谱和安排柱色谱两类。

吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入外表积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂(如氧化铝或硅胶)，当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶参加溶剂(洗脱剂)洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附力量不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。

连续用溶剂洗脱，吸附力量最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进展反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。

安排柱色谱是以硅胶、硅藻土和纤维等为支持剂，以吸附较大量的液体作为固定相，而支持剂本身不起分别作用。

本试验是把三氧化二铝填入玻璃管中(压成柱状)作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进展洗脱，从而到达叶绿体主要的4种色素(叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素)的分别。

在选择溶剂时主要依据下面几条原则:

(1)吸附剂要求较纯，否则会影响样品的吸附和洗脱。(2)溶剂和吸附剂不能起化学反响。

溶剂的极性应比样品小，假设大了，样品不宜被吸附剂吸附。

溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体积增加，易使色谱分散。

可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶解度太小。也可选用极性大的溶剂溶解，然后参加肯定量的非极性溶剂。这样既降低了极性，又削减了溶液的体积。

层析柱粗细必需均匀，柱管大小可依据试剂需要选择。一般来说，瘦长的柱分别效果较好。假设样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分别效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心局部的组份移动慢，而管壁四周的移动快。柱越长，分别效果越好，但柱过长，试验时间长，样品稀释度大，分别效果反而不好。

叶绿素存在两种构造相像的形式即叶绿素a(CHONMg)和叶绿素557254b(CHONMg)，其差异仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡

557064

咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进展光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基构造使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

胡萝卜素(CH)是具有长链构造的共轭多烯。它有三种异构体，即a-,β4056

-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进展工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。

叶黄素(CHO)是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两40562

倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

可用有机溶剂将上述色素萃取出来。而后用层析柱，以同样的或其他混合有机溶剂当洗脱剂，便可将这些色素分别。

试剂器材

材料烘干的菠菜叶

o试剂无水乙醇，石英砂，丙酮，石油醚(60-90C)，三氧化二铝，饱和氯化钠溶液，无水硫酸钠，洗脱液(丙酮:石油醚=1:9)

器材层析柱(1×30cm)，研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台

试验步骤色素提取

取20g青椒，加少许石英砂，再加20mL无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再参加30mL石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中，再参加40mL饱和氯化钠溶液震荡(留意不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象)。弃去下层溶液，再分别参加20mL水震荡洗

涤几次，直至下层无色，保存上层溶液，转移至锥形瓶中，用无水硫酸钠枯燥5min，备用。

样品浓缩

将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩10mL时停顿加热，用余热加热至剩余5~8mL，以备加样使用。

层析柱的制备

称取12g碱性三氧化二铝参加30mL石油醚搅拌，浸泡