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Wilmut克隆“多莉”的生物学意义具有丰富的保存卵细胞和其它细胞的经验掌握了熟练的核移植．等关键性技术对受精卵进行了电刺激处理，起激活作用采用细胞同步化技术，使受体和供体细胞均处在细胞周期的G0期已经成功的进行了先期克隆实验第27页，共56页，星期日，2025年，2月5日克隆的技术方法克隆的技术方法主要指以细胞核移植为核心技术的无性繁殖技术。细胞核移植技术：是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细操作技术。包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植两种。通过此技术可获得核质杂种。第28页，共56页，星期日，2025年，2月5日（1）受体细胞的去核：受体为成熟的卵细胞。盲吸去核法：用细胞骨架松弛剂（细胞松弛素或秋水仙素）处理卵母细胞，固定卵母细胞，吸管刺入透明带，吸取核轻轻拉出透明带，完成卵母细胞去核。功能去核法：通过紫外照射或者激光照射使染色体失活而达到去核的目的。化学诱导去核法：用脱羰秋水仙素处理减数分裂2期的卵母细胞使其排放第二极体。细胞核移植的技术要点第二极体：动物的卵原细胞减数第一次分裂结束形成的两个子细胞中的大细胞叫次级卵母细胞，小的叫第一极体（1个）；减数第二次分裂完形成的4个子细胞中那1个大细胞叫卵细胞，3个小的叫第二极体（3个）。第29页，共56页，星期日，2025年，2月5日（2）供体细胞的准备：供体通常选用胚胎细胞（发育至32-64个卵裂球的胚胎细胞）和胚胎干细胞（来自胚胎内细胞团）以及成年动物体细胞。供体细胞通常采用处于G0期的细胞。G0期细胞又称为“静止细胞”，“休止细胞”，其适合在适宜的条件下刺激进入增殖状态。血清“饥饿”法能够获得G0期的细胞。第30页，共56页，星期日，2025年，2月5日血清“饥饿”法如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处于同步状态？血清“饥饿法”使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹配的阶段，使结合在基因（DNA）上的调控蛋白脱落下来，细胞进入重新编程过程（reprogram,remodel）。第31页，共56页，星期日，2025年，2月5日（3）细胞移核：选择合适的微吸管穿过透明带注入去核卵母细胞中，避免移入过多的细胞质、控制温度，短时间内完成。还可用供核细胞和卵母细胞的融合实现核转移。直接注射法透明带注射法直接注射法第32页，共56页，星期日，2025年，2月5日（4）重组胚激活激活是通过某种刺激使卵子内钙离子浓度升高，给卵一个启动信号，促使细胞周期的恢复。电激活：通过电流刺激，使重组胚的核和质进行融合，从而激活重组胚。化学激活：使用化学物质（7%乙醇，离子霉素，钙离子载体等）刺激重组胚。（5）重组胚的培养和移植重组胚可以采用体外培养和体内培养两种方式。体外培养是将重组胚在特定培养液中培养至囊胚，选择优质胚移植入同期的受体中继续发育的过程。（6）核移植后代的鉴定常用分子生物学方法第33页，共56页，星期日，2025年，2月5日根据细胞核的来源不同，一般分为胚胎细胞核移植法、胚胎干细胞移植法、胎儿成纤维细胞移植法和体细胞核移植法，其基本程序大体一致。克隆动物的制备程序1）胚胎细胞核移植法：将未着床的早期胚胎分散成单个细胞，然后分别取核进行核移植，发育成胚胎后再行胚胎移植、发育分娩。也可通过细胞融合法将供体核移入去核卵的方法。2）胚胎干细胞移植：首先制作胚胎干细胞系，再进行细胞核移植，可克隆出更多的动物个体。此法在小鼠较为成熟。3）胎儿成纤维细胞核移植：从早期胎儿分离成纤维细胞进行核移植。4）体细胞克隆技术：1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植，成功地获得了克隆羊“多莉”。荣登Science杂志评出的1997年世界十大科技成就之首。第34页，共56页，星期日，2025年，2月5日核供体动物的选择与细胞核的获得核受体动物的选择与细胞核的移出供体核的移入及原核的取出胚泡的体外试管培养代母的选择与胚泡移入子宫克隆动物的体内发育与出生动物克隆的过程第35页，共56页，星期日，2025年，2月5日爪蟾的核移植实验1958年JohnGurdon和Machineer第36页，共56页，星期日，2025年，2月5日第37页，共56页，星期日，2025年，2月5日第38页，共56页，星期日，2025年，2月5日克隆技术的实践应用及意义遗传素质完全一致的克隆动物将有利于开展对动物（人）生长发育、衰老和疾病健康等机理的研究拯救濒临灭绝的动物（异种克隆、借腹怀胎），保护基因资源大量快速扩大和繁殖高经济性状（品质优良）的牲畜（禽）克隆转基因动物，创建活的药厂，