基因克隆的载体系统.pptVIP

第62页，共118页，星期日，2025年，2月5日?噬菌体载体一般用途：主要用于克隆DNA片段构建cDNA文库和基因组文库，并从中筛选目标基因亚克隆在大容量载体（如粘粒）中增殖的外源DNA片段第63页，共118页，星期日，2025年，2月5日第64页，共118页，星期日，2025年，2月5日?载体的体外包装（1）体外包装在试管中与?噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中包装过程:E基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。D基因的产物也是头部蛋白，但主要与?DNA进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。第65页，共118页，星期日，2025年，2月5日第66页，共118页，星期日，2025年，2月5日?DNA载体的优点?-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌?-DNA载体的装载能力为23kb，远远大于质粒的装载量重组?-DNA分子的筛选较为方便?-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，不适合表达外源基因用在真核生物基因组文库的建立第67页，共118页，星期日，2025年，2月5日三、柯斯质粒载体1、柯斯质粒载体的构建2、柯斯质粒载体的特点3、柯斯克隆4、柯斯克隆的改良第68页，共118页，星期日，2025年，2月5日考斯质粒与噬菌粒?-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为23kb和1.5kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量.在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。第69页，共118页，星期日，2025年，2月5日1粘粒载体（考斯质粒载体）粘粒的结构特征粘粒（cosmid）：一类由人工构建的含有?噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体．粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos位点,能象质粒一样转化（transform)和增殖(multiplication)大小：一般5-7kb左右，用来克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb第70页，共118页，星期日，2025年，2月5日考斯质粒（cosmid）pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI三部分组成:一个抗药性标记和一个质粒的复制起始位点带有?-DNAcos序列;一个或多个限制性内切酶的单一切割位点装载范围为31-45kb第71页，共118页，星期日，2025年，2月5日考斯质粒载体的特点能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围不能体内包装，不裂解受体细胞第72页，共118页，星期日，2025年，2月5日第73页，共118页，星期日，2025年，2月5日4、粘粒载体的工作原理分离外源DNA片断35-45kb外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同体外包装：?噬菌体A基因蛋白的末端酶功能作用下切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到?噬菌体颗粒中去线状的重组DNA注入细胞并通过cos位点环化，形成粘粒载体，象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。第74页，共118页，星期日，2025年，2月5日用途在构建基因文库中，减少重组体的数目在单个重组体中克隆和增殖完整的基因克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段在染色体步查（chromosomewalking)过程中具有优势，是λ噬菌体文库的两倍，可克隆45kb染色体步查：采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作探针，以鉴定含有相邻序列的重组克隆第75页，共118页，星期日，2025年，2月5日cosmid载体克隆的缺点载体片断自我连接外源DNA片断自我连接多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体第76页，共118页，星期日，2025年，2月5日cosmid载体