口腔粘膜细胞基因组制备.ppt

第1页，共17页，星期日，2025年，2月5日基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤。一、基因组DNA的提取与纯化目的：第2页，共17页，星期日，2025年，2月5日核酸分离纯化的总原则：?保证核酸一级结构完整?排除其它分子的污染：细胞内：蛋白质、脂类、糖、RNA等提取过程中：有机熔剂、金属离子、外源DNA第3页，共17页，星期日，2025年，2月5日细胞样品的核酸提取的主要步骤破碎细胞去除细胞内的其它分子：蛋白质多糖脂类去除盐类、有机溶剂等杂质第4页，共17页，星期日，2025年，2月5日核酸提取注意事项减少化学因素对核酸的降解如过量酸碱减少物理因素对核酸的降解机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融高温防止核酸的生物降解核酸酶的预防第5页，共17页，星期日，2025年，2月5日二、人基因组DNA的制备实验目的及意义：从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理第6页，共17页，星期日，2025年，2月5日分离纯化基因组DNA的常用方法：不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，因此它们有共同的步骤：裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质；析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。第7页，共17页，星期日，2025年，2月5日实验材料及试剂材料：人口腔上皮细胞试剂：抽提缓冲液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAase，SDS，蛋白酶K水饱和酚氯仿/异戊醇（V/V=24:1）75%乙醇、95%乙醇TE缓冲液：Tris，EDTA第8页，共17页，星期日，2025年，2月5日主要试剂的功能抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成SDS的作用是裂解细胞EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白质。酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA第9页，共17页，星期日，2025年，2月5日取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，用15ml离心管（4000rpm?10min）收集细胞沉淀①（离心机的使用，平衡）?加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5mlEP管（微量移液器的正确使用）混匀，65℃温育30min?加入等体积的饱和酚(0.5ml)，充分颠倒混匀（不要震荡！）P13实验步骤及注意事项（一人一组）：第10页，共17页，星期日，2025年，2月5日12000rpm?5min②，上层水相转移至新的EP管（高速离心机的使用与安全意识）?加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀12000rpm?5min，上层水相转移到新的EP管??加入2倍体积95%的乙醇，颠倒混匀12000rpm?10min③?第11页，共17页，星期日，2025年，2月5日第12页，共17页，星期日，2025年，2月5日