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国家计量技术规范规程制修订
《高通量测序仪校准规范》
（征求意见稿）实验报告
中国计量科学研究院
2023年2月
实验报告
一、实验目的
验证《高通量测序仪校准规范》的适用性和可行性。
二、实验地点
高通量测序仪验证实验在北京诺禾致源生物信息科技有限公司、北京贝瑞和康生物技术有限公司、北京六合华大基因科技有限公司、苏州元德友勤医学检验所等。
三、环境条件
实验过程中环境温度均在（15-35）?C，在校准过程中环境温度的变化均在3?C以内。实验过程中环境湿度均在（10-80）%RH在校准过程中环境湿度变化均在5%RH以内。
四、实验仪器与实验设计
在验证实验中，共对illumina公司、华大智造、贝瑞基因不同8台，包含NovaSeq6000（PE150/PE250）、NextSeqCN500（SE75/SE150）、MGI-2000(PE150)
（5种测序方式）高通量测序仪进行了30次验证实验。涵盖了市场上主要的高通量测序仪生产厂家和制造厂家。在实验设计上，按照校准规范对不同品牌的高通量测序仪进行校准，根据实验结果验证校准规范的可行性和有效性。
五、标准物质
实验使用可准确溯源、明确序列信息的片段化DNA序列标准物质。至少包含两种以上明确量值信息的参考序列，且每种参考序列长度≥5kbp。参考序列相对丰度的扩展不确定度≤15%(k=2)。
六、实验结果
NovaSeq6000高通量基因测序仪实验
根据校准规范的要求，采用混合标准物质对北京诺禾致源科技股份有限公司的NovaSeq6000高通量基因测序仪进行了验证实验。按校准规范要求的程序进行了Q20、Q30、GC含量、对比率、覆盖率、准确率等指标的检测，记录测量数据，
基础信息读长类型PE150设备最大通量
基础信息
读长类型
PE150
设备最大通量
6T
测定值
平均值
重复性
1
2
3
reads6922627873079607
5.34%
测定值
平均值
相对偏差
1
2
3
GC%
45%；44%
45%；44%
45%；44%
45%；44%
1.34%；0.34%
表1NovaSeq6000高通量基因测序仪验证实验结果
客户名称
北京诺禾致源生物科技有限公司
器具名称
高通量基因测序仪
型号/规格
NovaSeq6000(PE150)
出厂编号
A00609
生产厂商
Illumina
客户地址
北京市朝阳区酒仙桥北路甲10号院301号楼101单元7层714室
校准日期
2022年9月30日
校准环境条件及地点：
温度： 24.0 ℃ 地点：
湿度： 49.0 %RH 其它： /
依据《高通量基因测序仪校准作业指导书》对该仪器进行校准，结果如下：
一、读长总数（reads）重复性
二、GC含量占比偏差
三、碱基识别质量
测定值
平均值
参考指标
1
2
3
Q20
98.06%
98.08%
98.07%
98.07%
≥90%
Q30
94.22%
94.24%
94.42%
94.29%
≥85%
平均碱基错误率
0.02%
0.02%
0.02%
0.02%
≤0.05%
四、比对率重复性
五、序列覆盖率重复性
六、测序一致序列准确率
七、序列相对丰度偏差
测定值
平均值
相对偏差
重复性
1
2
3
序列相对丰度
47.77%
50.95%
51.36%
50.03%
2.19%
3.93%
测定值平均值重复性
测定值
平均值
重复性
参考指标
1
2
3
比对率
99.93%
99.97%
99.96%
99.95%
0.02%
≥99.00%
覆盖率
测定值
平均值
重复性
1
2
3
100Kreads
94.12%
93.97%
94.01%
94.03%
0.07%
1,000Kreads
94.79%
94.69%
94.96%
94.81%
0.12%
10,000Kreads
97.14%
97.00%
97.00%
97.05%
0.07%
准确率
测定值
平均值
重复性
参考指标
1
2
3
准确率
99.83%
99.84%
99.80%
99.82%
0.02%
≥99.50%
图
图1每个碱基的测序质量
图2每个序列的质量分数
以下空白。
NovaSeq6000高通量基因测序仪验证实验
根据校准规范的要求，采用混合标准物质对北京贝瑞和康生物技术有限公司的NovaSeq6000高通量基因测序仪进行了验证实验。按校准规范要求的程序进行了Q20、Q30、GC含量、对比率、覆盖率、准确率等指标的检测，记录测量数据，按规范中校准项目和校准方法规定计算结算了各项校准结果
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