DB13T 2404-2016 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法.pdfVIP

ICS65.020.20

B05

DB13

河北省地方标准

DB13/T2404—2016

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

2016-09-30发布2016-12-01实施

河北省质量技术监督局发布

DB13/T2404—2016

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北省畜牧局提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：袁万哲、孙继国、宋勤叶、马增军、金东航、李丽敏、张磊、李睿文。

I

DB13/T2404—2016

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于检测猪粪便、腹泻猪胃肠及其内容物和这些采集样品培养物中的猪流行性腹泻病毒。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）；

dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）；

EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）；

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）；

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）；

RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）；

Vero细胞：非洲绿猴肾细胞；

cDNA：互补脱氧核糖核酸。

3主要仪器

3.1PCR仪。

3.2凝胶成像系统。

3.3台式低温高速离心机。

3.4电泳仪。

3.5电泳槽。

3.6冰箱。

3.7微量移液器。

3.8水浴锅。

4主要试剂

4.1LSTRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。

4.2氯仿。

4.31.0%琼脂糖凝胶：见附录A中A.1。

4.450×TAE缓冲液：见附录A中A.2。

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4.510ug/μLEB或核酸染料：见附录A中A.3。

4.6DEPC处理的灭菌的双蒸水：见附录A中A.4。

4.7DNA分子量标准（100bp）。

4.8反转录酶。

4.9RNA酶抑制剂。

4.102×TaqMasterMix（Dye）。

4.11dNTP。

4.12商品化的一步法RT-PCR反应试剂：含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的

水等。

5引物

上游引物与下游引物见附录B。引物浓度为10μmol/L。

6样品对照

以灭活的猪流行性腹泻病毒Vero细胞培养物或者感染猪粪便、肠粘膜作为阳性对照，以正常Vero

细胞培养物或者是正常猪粪便、肠粘膜作为阴性对照。

7操作步骤

7.1样品的采集与处理。

7.1.1采集工具

采集工具应经121℃±2℃,20min高压灭菌并烘干。采集工具如下：

a)棉拭子；

b)剪刀；

c)镊子；

d)1.5mL离心管；

e)研钵。

7.1.2粪便采集