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细胞培养与冻存技术要点
演讲人：
日期:
目录
CATALOGUE
02
操作流程规范
03
污染控制措施
04
冻存技术要点
05
质量控制标准
06
应用与常见问题
01
基础原理与准备
01
基础原理与准备
PART
细胞培养基本概念
细胞株
传代培养
原代培养
细胞系
经过特殊处理能够持续传代培养的细胞群体。
直接从生物体内获取的细胞、组织或器官进行首次培养。
将原代培养的细胞经过分裂、增殖后，转移至另一培养容器中继续培养。
指可连续传代、具有特定生物学特性和遗传特性的细胞群体。
无菌环境
细胞培养过程中必须保持无菌操作，防止细胞污染。
适宜的温度与湿度
细胞生长需要适宜的温度和湿度，通常温度为37℃，湿度为95%左右。
合适的pH值
细胞生长需要适宜的酸碱度，一般维持在7.2-7.4之间。
气体环境
细胞生长需要氧气和二氧化碳，通常采用恒定的空气流通或培养箱进行培养。
实验室条件要求
试剂与耗材选择
培养基
根据细胞类型选择适宜的培养基，包括基础培养基和添加物。
血清
常用的细胞培养添加剂，提供细胞生长所需的生长因子和其他营养物质。
抗生素与抗真菌剂
用于预防细胞污染，常用抗生素包括青霉素和链霉素等。
消化酶
用于细胞传代时消化贴壁细胞，使细胞从培养瓶壁上脱落并分散成单个细胞。
02
操作流程规范
PART
原代培养步骤
样本选取与处理
培养基配制
培养条件设置
细胞观察与记录
选取新鲜、无污染的组织或细胞，剪碎并用胰酶等酶类处理，使其分散成单个细胞。
根据细胞特性选择合适的培养基，加入血清、生长因子等必需物质。
将细胞接种至培养皿中，置于恒温、恒湿、无菌环境下培养，定期更换培养基。
在倒置显微镜下观察细胞形态、生长速度等，及时记录。
传代操作要点
当细胞达到一定密度时，需进行分离传代，可用胰酶等消化后按比例传代。
细胞分离与传代
将传代后的细胞重新接种至新的培养皿中，继续培养并观察其生长状况。
传代后培养
为避免细胞老化或发生遗传变异，需严格控制传代次数。
传代次数控制
冻存与复苏流程
细胞冻存
选取状态良好的细胞，加入冻存液后置于低温环境下逐渐降温，最终放入液氮中长期保存。
01
细胞复苏
从液氮中取出冻存管，迅速放入温水中解冻，离心后去除冻存液，加入新鲜培养基后继续培养。
02
复苏后观察
复苏后的细胞需在特定条件下培养一段时间，观察其生长状态及活性。
03
03
污染控制措施
PART
常见污染源分析
物理污染
如温度波动、辐射、振动等，可能影响细胞生长。
03
来自培养基、血清、抗生素、消毒剂等。
02
化学污染
微生物污染
包括细菌、真菌、病毒等，主要来自空气、水、操作人员、设备等。
01
无菌操作关键点
包括实验操作者的无菌准备，如穿戴无菌衣、手套、口罩等，以及实验区域的消毒。
实验前准备
实验操作过程
实验后处理
遵循无菌操作规程，避免交叉污染，如使用无菌器材、培养基、试剂等。
及时清理实验区域，废弃物进行无害化处理，实验器材进行彻底消毒。
立即停止细胞培养，使用适当的消毒剂或抗生素进行处理，并追查污染来源。
微生物污染处理
立即停止使用污染的培养基或试剂，更换无污染的培养基，并检查对细胞的影响。
化学污染处理
对于温度波动、辐射等物理污染，及时调整培养条件，确保细胞处于适宜的生长环境中。
物理污染处理
污染后处理方法
04
冻存技术要点
PART
冻存保护剂选择
DMSO
是最常用的冻存保护剂，能够降低冰点，减少冰晶形成，保护细胞免受低温损伤。
01
血清
可以提供营养物质和生长因子，同时具有一定的保护作用。
02
糖类物质
如海藻糖、蔗糖等，可以在细胞内部形成玻璃态，保护细胞结构。
03
程序降温方法
分步降温
将细胞先放在一定温度下预冷一段时间，然后再进行快速或慢速降温，以更好地保护细胞。
03
通过迅速降低温度，使细胞在较短时间内达到冻存状态，减少冰晶形成。
02
快速降温
慢速降温
通过逐步降低温度，使细胞内的水分逐渐结冰，减少冰晶对细胞的损伤。
01
长期储存注意事项
储存温度
储存容器
防止污染
定期检查
液氮罐中长期储存的细胞应放置在-130℃以下的环境中。
选择能够承受极低温度且不易破裂的储存容器，如冻存管、冻存瓶等。
储存过程中要注意防止微生物的污染，操作时要严格遵守无菌操作规程。
定期检查储存容器是否漏气、液氮是否充足以及细胞状态是否正常。
05
质量控制标准
PART
细胞活性检测
通过细胞增殖实验评估细胞活性，如MTT法、克隆形成率等。
细胞增殖能力
用显微镜观察细胞形态，如细胞大小、形状、折光性等，以评估细胞健康状态。
细胞形态观察
绘制细胞生长曲线，评估细胞增殖速度及活性。
细胞生长曲线
细胞鉴定方法
细胞表面标志物
通过流式细胞术或免疫荧光染色鉴定细胞表面标志物，以确认
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