《中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测 等温扩增-CRISPR cas13a法》.docxVIP

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T/ASAC012—2025

中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测等温扩增-CRISPRcas13a法

DetectionofChineseHoneybeePupaVirusbyIsothermalAmplification-CRISPRCas13aMethod

（征求意见稿）

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

发布实施

中国养蜂学会发布

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由华中农业大学提出。

本文件由中国养蜂学会归口。

本文件起草单位：湖北省养蜂学会、华中农业大学。

本文件主要起草人：李翔、曹胜波、刘娜、张朝、庞雯元、刘嘉维、方芳、王振。

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引言

自1972年起，中华蜜蜂囊状幼虫病在我国由南至北发生多次大规模流行，致使养蜂业损失惨重，严重阻碍了虫媒植物的生长，对生态平衡造成了破坏。鉴于目前尚未建立培养中华蜜蜂囊状幼虫病毒（CSBV）株的细胞系，因此一直以来都缺乏有效的疫苗、试剂及药物治疗手段。CSBV的防控策略主要依赖于快速诊断，并切断病蜂以及污染物等各类传染源，所以在临床诊断中，能否快速且准确地诊断CSBV，对于早发现疫情和提前采取预防措施起着至关重要的作用。

目前，CSBV的实验室诊断方法主要是利用电镜直接观察病毒形态以及荧光定量PCR等技术方法，其操作需要昂贵仪器且需要专业人员接受长时间的培训。实际生产中急需便利、准确、快速且成本低廉的检测方法。

本文件我们开发了一种基于等温扩增-CRISPR/Cas13a的快速、灵敏和特异CSBV检测方法，这种方法结合重组酶介导的等温核酸扩增技术（RecombinaseAidedAmplification,RAA）和侧向流动试纸条，能够灵敏地检测出极少量的核酸模板，测试反应仅需几分钟，其检测结果可视化，能让检测人员对疾病作出迅速判断，有望应用于早期CSBV的防控。

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中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测等温扩增-CRISPRcas13a法

1范围

本文件描述了利用等温扩增-CRISPRcas13a测定中华蜜蜂囊状幼虫病毒的方法。

本文件适用于中华蜜蜂囊状幼虫病毒的检测。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

中华蜜蜂囊状幼虫病毒chinesesacbrooddiseasevirus,CSBV

一种属于蜜蜂囊状幼虫病病毒的无囊膜的单链RNA病原体。

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3.2

规律间隔成簇短回文重复序列CRISPR效应蛋白，CRISPRcas13a

一种基于CRISPR-Cas系统、专门用于RNA水平进行靶向切割的RNA酶。

3.3

重组酶介导等温核酸扩增技术，recombinaseaidedamplification，RAA

一种基于重组酶介导的在恒温条件下实现的核酸扩增的技术。

4原理

基于CSBV的DNA序列，研究人员设计了一种能够靶向中华蜜蜂囊状幼虫病毒特异性序列的向导RNA探针（见附录A）。向导RNA一旦识别出特异性序列，Cas13a核酸酶则被激活且具有RNA酶活性，进而发挥功能切断特殊的报告分子，使得报告分子在试纸条上出现条带。通过不同位置条带的有无，即可判断病毒的存在与否。

5试剂和材料

除另有说明，所用试剂均为分析纯，且均用无RNA酶的容器分装。

5.1MagZol?Reagent：RNA分离试剂，4℃保存。

5.2氯仿：4℃预冷。

5.3异丙醇：4℃预冷。

5.4DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC。

5.5Oligod(T)23VN：通用引物。

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5.6dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（2.5mmol/L）。

5.7ABScriptⅡReactionMix(2×)：逆转录反应缓冲液。

5.8ABScriptⅡEnzymeMix(10×)：逆转录酶。

5.9琼脂糖凝胶：1.0%。

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