生物化学及分子生物学人卫第八版常用分子生物学技术的原理及应用.pptxVIP

惯用分子生物学技术原理及应用

ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology;第一节;核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)

在DNA复性过程中，假如把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA单链分子之间有一定碱基配对关系，就能够在不同分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。;;（一）印迹技术;用放射性核素、生物素或荧光染料标识其末端或全链已知序列多聚核苷酸链被称为“探针”，探针能够与固定在NC膜上核苷酸结合，判断是否有同源核酸分子存在。;二、印迹技术类别及应用;其它：

斑点印迹(dotblotting)

原位杂交(insituhybridization)

DNA点阵(DNAarray)

DNA芯片技术(DNAchip);三种印迹技术比较;分子杂交试验;放射自显影照片;DNA点阵;第二节;5?;Cycle3;模板DNA

特异性引物

耐热DNA聚合酶

dNTPs

Mg2+;PCR基本反应环节;利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板取得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞mRNA为模板取得目的片段；

利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中取得序列相同基因片段；

利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。;利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。;将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提升了测序速度；

待测DNA片段既可克隆到特定载体后进行序列测定，也可直接测定。;逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA逆转录反应和PCR反应联合应用一个技术。

RT-PCR是当前从组织或细胞中取得目的基因以及对已知序列RNA进行定性及半定量分析最有效办法。;原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上单个细胞内进行PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。

原位PCR办法填补了PCR技术和原位杂交技术不足，是将目的基因扩增与定位相结合一个最佳办法。;（三）实时PCR技术;实时PCR技术原理;第三节;核酸序列分析基本原理：;一、DNA链末端合成终止法;G;二、DNA自动测序;;第四节;基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)

cDNA文库(cDNAlibrary);一、基因组DNA文库;基因组文库和cDNA文库构建和??选;第一轮筛选;cDNA文库是包括某一组织细胞在一定条件下所表示所有mRNA经逆转录而合成cDNA序列克隆群体，它以cDNA片段形式贮存着该组织细胞基因表示信息。;第五节;是指将许多特定DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积支持物上，然后与待测荧光标识样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点荧光信号做出检测、比较和分析，从而快速得出定性和定量结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。;基因芯片工作流程示意图;是将高度密集排列蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析一个技术。;第六节;一、蛋白质互相作用研究技术;标签融合蛋白结合试验是一个基于亲和色谱原理、分析蛋白质体外直接互相作用办法。;标签融合蛋白沉淀试验流程示意图;（二）酵母双杂交技术基本原理和用途;酵母双杂交系统应用;电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或称凝胶迁移变动试验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间互相作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究典型办法。当前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间互相作用。;;染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是当前能够研究体内DNA与蛋白质互相作用主要办法。;染色质免疫沉淀试验流程及结果示意图;遗传修饰动物模型建立及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel;转基因技术

采用基因转移技术使目基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。;第53页;核转移技术

即动物