血球计数板的操作步骤.docxVIP

细胞悬液制备（针对贴壁生长细胞）

若计数对象为贴壁生长的细胞，需先将培养物制备成细胞悬液，步骤如下：

终止培养并清洗：终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。

消化细胞：给培养瓶内加入1ml0.25%胰蛋白酶溶液，于37℃消化3-5min，期间不断在镜下观察。当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。

制成细胞悬液：加入一定量的培养液（若培养细胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。

对于悬液培养的细胞，可直接进行下一步计数与计算过程。

计数与计算过程

准备

放置盖玻片：在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

样本处理：若样本浓度过高，需将待测样本溶液进行适当稀释，一般用生理盐水或无血清培养液进行稀释，以便在显微镜下观察到单个细胞。同时将血球计数板放在显微镜下，调整显微镜焦距，使视野清晰，确保盖玻片与载玻片之间的密封性，避免细胞逸出。

加样

用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹糟处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

计数

选择计数区域：置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于16格×25格规格的计数室，应按照对角线位置，选取左上、右上、左下、右下四个中格的细胞进行计数（即统计100个小方格中的细胞数）；若使用25格×16格的计数室，选择方式类似。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

多次计数：对每个样品进行三次计数，取平均值，以保证结果的准确性。

计算细胞密度

按下式计数细胞悬液的密度：

通用公式：细胞密度=(4个大格细胞总数/4)×10?个/ml。

对于16格×25格的血球计数板，酵母细胞数/ml=(100小格内酵母细胞个数/100)×400×10?×稀释倍数。

对于25格×16格的血球计数板，酵母细胞数/ml=(80小格内酵母细胞个数/80)×400×10?×稀释倍数。

注意事项

务必使细胞分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。

显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团10%，说明细胞分散不充分。

使用完血球计数板后，应先用自来水轻轻冲洗，注意避免使用硬物刷洗。

在加入细胞悬液时要避免产生气泡，否则会影响计数的准确性。

在进行血细胞计数时，需要多次重复以获得准确的结果，确认计数的重复性是否良好，如果结果差异较大，需要重新进行计数。